范作良　鞠 雷　李汝春　陳風(fēng)梅　（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院　山東 濰坊　261061）賈慧卿?。H坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司　山東 青州）

丙冬甘寧中藥發(fā)酵用微生物及發(fā)酵條件的篩選

范作良鞠 雷李汝春陳風(fēng)梅（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院山東 濰坊261061）
賈慧卿（濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司山東 青州）

摘要本研究篩選出最佳發(fā)酵菌為枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵受碳源、氮源、溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基的ph值等多種因素的影響，通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH值對芽孢桿菌的發(fā)酵影響顯著，應(yīng)采取控制pH在6.0左右；發(fā)酵時(shí)間達(dá)到一個(gè)定值之后，芽孢桿菌的數(shù)量不會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長增加而增加，因此在生產(chǎn)中采取的發(fā)酵時(shí)間為52h；芽孢桿菌發(fā)酵的最適溫度在32～37℃時(shí)，芽孢桿菌的濃度變化不大，根據(jù)生產(chǎn)的需要，采取35～37℃。

關(guān)鍵詞中藥發(fā)酵微生物篩選

肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)重要而具有特殊功能的代謝器官，對體內(nèi)的代謝、消化、排泄、解毒以及免疫等過程具有重要作用。病毒、代謝毒物、藥物、各種理化因素等均可導(dǎo)致肝臟損傷或者肝功能障礙，動(dòng)物肝臟疾病的防治已經(jīng)成為當(dāng)前人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一［1］。近年來，由于各種因素導(dǎo)致肝臟疾病的頻發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。梔子、甘草、柴胡、五味子、丹參等中藥作為保肝藥物已經(jīng)有很長的應(yīng)用歷史［2-6］，將這幾味藥組方為丙冬甘寧，本文利用有益菌將丙冬甘寧提取物進(jìn)行發(fā)酵處理，篩選最優(yōu)的有益菌及發(fā)酵條件，達(dá)到提高藥效的目的。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、布拉酵母菌上述菌種均購自重慶力克生物有限公司，經(jīng)鑒定為有活力的生物菌種。

1.1.2中藥提取液由濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3培養(yǎng)基芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g、大豆蛋白胨10g、氯化鈉5g、水1L、pH值7.0、0.1MPa滅菌

20min。酵母菌種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15，酵母5，MgSO4·7H2O 0.25，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5?；A(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g、硫酸銨7g、水1L，KH2PO40.5g、pH值7.0、0.1MPa滅菌20min。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵用菌種（1）種子液的制備：分別將芽孢桿菌和酵母菌從保存的斜面轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面，于37℃培養(yǎng)18h。取培養(yǎng)好的斜面，用接種環(huán)挑1環(huán)接種于，盛有50ml無菌種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，然后置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中，3 7℃振蕩培養(yǎng)2 4h，轉(zhuǎn)速為120r/min。（2）搖瓶培養(yǎng)：分別取種子液，超凈工作臺(tái)上接入盛有50ml無菌種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為10%（V/V）。置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，37℃培養(yǎng)30h，培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)?；罹?jì)數(shù)方法：采用傾注法按10倍稀釋法制成不同濃度稀釋液，從3 種合適的稀釋液中分別吸取0.2ml置于無菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做3個(gè)平皿。將事先融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，向每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入約10ml搖勻，待凝固后，37℃倒置培養(yǎng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。通過菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，種子液中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌，布拉酵母菌的菌落數(shù)分別為8.7×107/ml，9.1×107/ml，6.4×107/ml，5.2×107/ml。（3）中藥發(fā)酵培養(yǎng)基的配置：將制得的中藥提取液中代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的水，并加入尿素，并調(diào)節(jié)pH至6.0制成中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖20g，硫酸銨8g，中藥提取液1L，KH2PO40.5g，NaHCO3適量。（4）菌種篩選：分別將制得的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌，布拉酵母菌接種到中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為10%（V/V）。置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，37℃培養(yǎng)30h。培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)。1.2.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵條件通過單因素試驗(yàn)改變發(fā)酵條件，尋找相關(guān)因素對芽孢桿菌在中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1所示。按照每一個(gè)因素分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

表1　單因素不同水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2　結(jié)果

2.1確定發(fā)酵用菌種

測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，結(jié)果如表2。

表2　不同菌種在中藥發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)　?。ā?07/ml）

通過比較發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能夠在中藥發(fā)酵液中正常生長，并不斷增值，而酵母菌不能在中藥發(fā)酵液中增值，因此確定以芽孢桿菌作為菌種。

2.2芽孢桿菌的發(fā)酵效率

通過比較發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的發(fā)酵效率相差不大，都能夠在中藥發(fā)酵液中長期生長繁殖，因此，研究了不同比例的芽孢桿菌對在中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的產(chǎn)率，接種濃度均為10%，結(jié)果如表3。

表3　不同比例的芽孢桿菌發(fā)酵效率（枯草：地衣）　　?。?）

通過結(jié)果可以看出，不同比例的芽孢桿菌發(fā)酵后，產(chǎn)生的芽孢桿菌的數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），由于不同的產(chǎn)孢桿菌產(chǎn)生的酶及對中藥的代謝，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不同，因此，采用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的比例為1:1的混合菌種作為種子液發(fā)酵。

2.3葡萄糖濃度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中葡萄糖的含量配置不同葡萄糖濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件為：硫酸銨8g，中藥提取液1L，KH2PO4 0.5g，用適量NaHCO3調(diào)節(jié)pH值到6.0，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量為10%（v/v），置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，37℃培養(yǎng)36h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察碳源對芽孢桿菌發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖1。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在10～15g/L之間時(shí)，就能滿足自身的需要，當(dāng)葡萄糖的濃度高于15g/L時(shí)，芽孢桿菌的發(fā)酵不會(huì)隨著糖濃度的升高，芽孢桿菌繼續(xù)發(fā)酵，此時(shí)，多余的糖分將溶解在發(fā)酵液中，芽孢桿菌產(chǎn)生分解產(chǎn)生的碳源能夠滿足自身的需求。

圖1　葡萄糖濃度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

圖2　硫酸銨濃度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.4硫酸銨濃度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中硫酸銨的含量配置不同硫酸銨濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件為：葡萄糖20g、中藥提取液1L、KH2PO40.5g，用適量NaHCO3調(diào)節(jié)pH值到6.0，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量為10%（v/v），置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，37℃培養(yǎng)36h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察氮源對芽孢桿菌發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2。當(dāng)硫酸銨的濃度6g/L時(shí)，芽孢桿菌的生長曲線，將不會(huì)繼續(xù)上升，硫酸銨的濃度在8g/L時(shí)，芽孢桿菌的濃度與6g/L相差不明顯，但是當(dāng)硫酸銨的濃度為4g/L時(shí)，芽孢桿菌的濃度將顯著低于6g/L，因此，可以推斷培養(yǎng)基中硫酸銨的濃度最佳在6g/L左右。

2.5pH值對芽孢桿菌濃度變化的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中發(fā)酵液的pH值配置不同酸度濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件為：葡萄糖20g、硫酸銨8.0g、中藥提取液1L、KH2PO40.5g，用適量NaHCO3和鹽酸調(diào)節(jié)pH值，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量為10%（v/v），置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，37℃培養(yǎng)36h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察pH值對芽孢桿菌發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖3。當(dāng)ph值有小的變動(dòng)時(shí)，發(fā)酵液中芽孢桿菌的濃度也會(huì)伴隨著較大的變動(dòng)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，芽孢桿菌的最佳pH值為6.0。

2.5溫度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照葡萄糖20g、硫酸銨8.0g、中藥提取液1L、KH2PO40.5g，用適量NaHCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的pH值為6.0，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量為10%（v/v），置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，分別在24、28、32、37℃，42℃培養(yǎng)36h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察溫度對芽孢桿菌發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4。隨著溫度的升高，發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量不斷增加，當(dāng)溫度在32～37℃芽孢桿菌的數(shù)量達(dá)到最高值，當(dāng)發(fā)酵溫度是42℃時(shí)，發(fā)酵液中的芽孢桿菌濃度呈現(xiàn)下降趨勢，說明溫度升高，芽孢桿菌將停止生長，形成芽孢度過溫度不適的階段。因此，芽孢桿菌發(fā)酵的溫度控制在32～37℃之間。

溫度（℃）

2.6接種量對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照葡萄糖20g、硫酸銨8.0g、中藥提取液1L、KH2PO40.5g，用適量NaHCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的pH值為6.0，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量按照表2～3設(shè)置的濃度分別接種為10%，置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，分別在37℃，培養(yǎng)36h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察接種量對芽孢桿菌發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖5。發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量隨著接種量的增加而增加，5%～10%之間時(shí)，芽孢桿菌的數(shù)量相差不大，從圖可以看出發(fā)酵液的最佳接種量在8%左右，當(dāng)接種量大于10%，會(huì)造成部分菌種的浪費(fèi)，低于5%，芽孢桿菌發(fā)酵不充分，其中的部分營養(yǎng)物質(zhì)不能得到利用。

2.7發(fā)酵時(shí)間對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

將5個(gè)錐形瓶清洗干凈，滅菌后，按照葡萄糖20g、硫酸銨8.0g、中藥提取液1L、KH2PO40.5g，用適量NaHCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的pH值為6.0，每個(gè)錐形瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基50ml，接種量按照表2～3設(shè)置的濃度分別接種為10%，置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，分別在37℃培養(yǎng)28、36、44、52、60h。以發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量作為考察指標(biāo)，來考察發(fā)酵時(shí)間對芽孢桿菌發(fā)酵效果的影響，結(jié)果如圖6。發(fā)酵時(shí)間與芽孢桿菌的濃度可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量會(huì)繼續(xù)增加，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到52h后，發(fā)酵液中芽孢桿菌的數(shù)量不再隨著時(shí)間的延長繼續(xù)增加，因此，最佳的發(fā)酵時(shí)間為52h。

圖5　接種量對芽孢桿菌發(fā)酵的影響

圖6　發(fā)酵時(shí)間對芽孢桿菌在中藥發(fā)酵基質(zhì)中發(fā)酵的影響

3　結(jié)論

不同比例的芽孢桿菌發(fā)酵后，產(chǎn)生的芽孢桿菌的數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），由于不同的產(chǎn)孢桿菌產(chǎn)生的酶及對中藥的代謝，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不同，因此，采用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的比例為1:1的混合菌種作為種子液發(fā)酵。

芽孢桿菌的發(fā)酵受碳源，氮源，溫度，接種量，發(fā)酵時(shí)間，培養(yǎng)基的ph值等多種因素的影響，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在10～15g/L、硫酸銨的濃度在6g/L、pH值6.0、溫度32～37℃、發(fā)酵液的接種量在8%左右、發(fā)酵時(shí)間52h為最佳。

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中圖分類號(hào)：S816.76

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2015）04-0003-03

收稿日期：（2015-01-13）