王志敏，包 珊

(1.南華大學(xué)， 湖南 衡陽 421001; 2.海南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 海南 ?？?570100)

?

研究論文

肝細(xì)胞生長因子促進(jìn)HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

王志敏1,2，包 珊2*

(1.南華大學(xué)， 湖南 衡陽 421001; 2.海南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 海南 ?？?570100)

目的探討肝細(xì)胞生長因子對宮頸癌HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法以不同濃度的HGF(0、5、10、20和40 ng/mL)處理細(xì)胞24 h或20 ng/mL 肝細(xì)胞生長因子(HGF)處理細(xì)胞不同時間(0、6、12、24和48 h)，MTT檢測細(xì)胞活力；用HGF(20 ng/mL)處理細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)，劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移及Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力。Western blot檢測上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-Cadherin及轉(zhuǎn)錄因子snail和間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá)， HGF/c-Met信號通路分子的表達(dá)情況。結(jié)果HGF促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖，其中以20 ng/mL或20 ng/mL處理24 h生存率達(dá)到最高峰；此外，HGF可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)c-Met磷酸化，并且激活p-ERK、p-AKT以及促進(jìn)snail 的蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論HGF可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能是通過HGF/c-Met/MAPK或HGF/c-Met/AKT通路上調(diào)snail表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控E-cadherin或vimentin表達(dá)有關(guān)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；肝細(xì)胞生長因子；宮頸癌

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細(xì)胞在特殊的生物信號的調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞表型的生物過程，其是惡性腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[1- 2]。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是由間質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的，具有多種生物學(xué)功能的生物信號分子，其可以通過調(diào)控其特異性受體c-Met的活性，從而影響惡性腫瘤(如前列腺癌、肺癌和胃癌等)的侵襲及轉(zhuǎn)移[3- 5]，然而其在宮頸癌中是否具有同樣的作用目前尚不清楚。最近研究顯示，在宮頸癌中c-Met存在高表達(dá)[6]，這提示HGF有可能通過激活c-Met，進(jìn)而影響其下游信號分子，從而調(diào)控宮頸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞作為研究對象，觀察HGF對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲、遷移的影響，并初步探討HGF誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制，從而為宮頸癌的治療提供新的方向及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宮頸癌HeLa細(xì)胞(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)；肝細(xì)胞生長因子(Invitrogen公司)；二甲基亞砜(DMSO) (Sigma公司)； DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone公司)；無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； E-cadherin，vimentin兔抗人一抗(Santa Cruz公司)，p-Met、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK兔抗人一抗(CST公司)；snail，c-Met，β-actin 抗體(Abnova公司)；HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、ECL化學(xué)發(fā)光劑試劑盒(杭州碧云天公司)； BCA蛋白定量試劑盒(北京康為生物技術(shù)有限公司)； SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京鼎國生物有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermantas公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(UltraSYBR Mixture)(北京康為生物技術(shù)有限公司)； PCR引物設(shè)計合成(上海生物工程股份有限公司)，其余的生物試劑均是國產(chǎn)或國外分析純以上。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用Hyclone的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)基內(nèi)加入10%胎牛血清，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。此后，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)每隔1～2 d換1次新鮮培養(yǎng)液，并根據(jù)實際情況每隔2～3 d進(jìn)行傳代，實驗時選擇處于對數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞活力檢測

將處于對數(shù)期的HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，隨后接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔培液為100 μL(約為8×103細(xì)胞/孔)。根據(jù)分組的情況每個組設(shè)置4個復(fù)孔，隨后將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(條件：37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)至12 h，用不同濃度的HGF(0、5、10、20和40 ng/mL)處理細(xì)胞或20 ng/mL HGF處理不同時間(0、6、12、24和48 h)。隨后在無光的條件下加入 20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，于室溫孵育4 h，接著將上清液倒棄，隨后每孔加入150 μL的DMSO (避光進(jìn)行)。最后將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，混勻。用空白孔進(jìn)行調(diào)零，并于 490 nm的波長下測定每孔的吸光度值(A)。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。細(xì)胞的活力(%)=(處理組的A值-空白組的A值)/(對照組的A值-空白組的A值)×100%。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測

實驗時用胰蛋白酶使貼壁的細(xì)胞脫落，并用培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液，隨后接種于6孔板(每孔2 mL，細(xì)胞大約為3×105個細(xì)胞/mL)。然后將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(條件: 37 ℃、5% CO2)12 h。細(xì)胞長滿后取無菌的10 μL的槍頭在6孔板的每個孔上進(jìn)行劃痕，劃完后用無菌的的PBS清洗3遍，除去槍頭劃下的細(xì)胞，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基。將6孔板放置在倒置顯微鏡下，并取各培養(yǎng)孔中細(xì)胞劃痕的寬度相等的位置進(jìn)行拍照。隨后將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(條件：37 ℃、5% CO2)，培養(yǎng)24 h后，再用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板的相同一位置上細(xì)胞遷移的情況并拍照。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測

在培養(yǎng)板中放入 Transwell小室，接著將無血清培養(yǎng)基(300 μL)的在Transwell小室的上室，并于室溫下放置15～20 min，待基質(zhì)膠重新水化后。隨后取200 μL的細(xì)胞懸液(約為3×105個/mL)加入Transwell 小室中的上室。與此同時在下室加入500 μL的新鮮培養(yǎng)基(含胎牛血清)。然后根據(jù)具體的分組用HGF處理 Transwell 上室的細(xì)胞。待孵育24 h后，對下室的基質(zhì)膠膜的細(xì)胞進(jìn)行染色，隨機(jī)篩取5個視野進(jìn)行計數(shù)分析。

1.6 蛋白提取和Western blot分析

收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞的總蛋白，按照BAC試劑盒操作說明書測定蛋白質(zhì)濃度。按照SDS-PAGE操作說明書配置5%濃縮膠和8%分離膠進(jìn)行電泳，每孔的上樣量30 μg，條件恒壓80 V 30 min，120 V 70 min，電泳完畢后根據(jù)Mark顯示，切取相應(yīng)膠帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜前PVDF膜甲醇浸泡15 min，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200 mA 2 h，隨后用5%牛奶(TBST配置)封閉6 h，隨后E-cadherin、vimentin、c-Met一抗以1∶500比例稀釋；AKT、p-AKT、ERK、p-ERK一抗以1∶1 000比例稀釋；snail、β-actin一抗均以1∶2 000 比例稀釋，4 ℃ 孵育過夜。經(jīng) TBST 洗滌3次后，每次10 min(注意磷酸化抗體洗滌時應(yīng)輕柔)，加入HRP標(biāo)記的特異性二抗以1∶2 000比例稀釋，室溫下孵育2 h，加入ECL發(fā)光劑，于成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶。并用Labwork凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HGF對HeLa細(xì)胞的增殖以及形態(tài)的影響

HGF可以呈濃度及時間依賴性的上調(diào)細(xì)胞增殖，其中以20 ng/mL處理濃度及20 ng/mL處理24 h細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)，之后均無明顯變化(圖1A，B)，故以20 ng/mL HGF處理24 h作為處理條件。與對照組相比HGF處理細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞形態(tài)由多角形變?yōu)殚L梭型，由“鋪路石”樣緊密相連變?yōu)榧?xì)長“間質(zhì)細(xì)胞樣”散在生長(圖1C)。

2.2 HGF對HeLa細(xì)胞遷移的影響

分組處理24 h，對照組遷移(39.54±1.34)μm，顯著低于HGF處理組的(79.56±1.67)μm(圖2)(P<0.05)。此外， HGF處理后細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)目為130±7個，顯著高于對照組的(52±6)個，增高2.5倍(圖3)(P<0.05)。

A.the effect of different concentration HGF on HeLa proliferation; B.the effect of HGF on HeLa proliferation in different times; C.the effect of HGF on morphological of HeLa cells

圖1 HGF對HeLa細(xì)胞增殖及形態(tài)的影響

Fig 1 The effect of HGF on proliferation and morphological(×400)

圖2 HGF對HeLa細(xì)胞遷移的影響

圖3 HGF對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 3 The effect of HGF on cell migration(×200)

2.3 HGF對HeLa細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響

HGF處理HeLa 24 h后，HGF可以明顯地下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)vimentin蛋白表達(dá)，并促進(jìn)snail蛋白表達(dá)(圖4,表1)。

2.4 HGF對c-Met表達(dá)及下游AKT、MAPK通路的影響

與對照組相比， HGF可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞p-c-Met、p-AKT和p-ERK的表達(dá)(P<0.05),但c-Met、AKT和ERK表達(dá)并無明顯改變(表2,圖5)。

圖4 HGF對HeLa細(xì)胞E-cadherin、vimentin及snail蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effect of HGF on the protein expression of E-cadherin, vimentin and snail

groupE?cadherinvimentinsnailcontrol 089±007 015±010 012±008HGF 040±011? 094±012?? 095±013??

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

表2 Western blot檢測 p-Met、Met、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)

groupp?Metp?AKTp?ERKMetAKTERKcontrol 013±005 018±006 018±007092±014095±015096±012HGF 091±014? 090±013? 089±012?094±015096±011096±016

*P<0.05 compared with control.

圖5 HGF對c-Met表達(dá)及下游AKT、MAPK通路的影響Fig 5 The effect of HGF on the c-Met expression and AKT, MAPK signaling

3 討論

宮頸癌的患者的死亡主要由于癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。而癌細(xì)胞的EMT是癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[7]。癌細(xì)胞在發(fā)生 EMT 改變的時，除了細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)換外，其表達(dá)的標(biāo)志物也會隨之發(fā)生相應(yīng)的改變，比如上皮細(xì)胞來源的標(biāo)記蛋白如: E-cadherin、緊密連接蛋白 ZO-1 等表達(dá)降低，而代表間質(zhì)細(xì)胞來源的標(biāo)記蛋白如: vimentin、N-cadherin 等表達(dá)升高，從而引起了癌細(xì)胞之間黏附能力的下降，加快細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8- 9]。

HGF是一種具有多重效應(yīng)的生長因子，它能促進(jìn)上皮細(xì)胞包括癌細(xì)胞的運(yùn)動和生長[10]。現(xiàn)已證明，HGF可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞(如肺癌、肝癌和前列腺癌細(xì)胞等)發(fā)生EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展[4,11- 12]。在當(dāng)前的研究中，HGF 明顯促進(jìn)HeLa細(xì)胞EMT變化：細(xì)胞形態(tài)原來緊密連接飽滿的多角形 “上皮樣”細(xì)胞變?yōu)樯⒃诜植嫉亩趟笮巍伴g質(zhì)樣”細(xì)胞；細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力；細(xì)胞的E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，與vimentin的表達(dá)升高有關(guān)。

酪氨酸激酶受體 c-Met，是介導(dǎo)HGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的核心受體，目前大量的研究顯示，HGF可以通過激活c-Met受體，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游信號通路如MAPK、AKT通路，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移[10,13]。Snail作為調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示其可以通過與 E-cadherin 啟動子部位的 E-box結(jié)合，從而抑制E-cadherin基因的表達(dá)[14]。而MAPK信號通路作為HGF/c-Met下游信號，ERK的活化可以激活轉(zhuǎn)錄因子snail[15]。在當(dāng)前的實驗中， HGF確實激活宮頸癌細(xì)胞的c-Met受體，并隨之激活其下游的信號分子ERK、AKT，促進(jìn)snail表達(dá)。因此，HGF很可能是通過激活c-Met-ERK信號通路，上調(diào)snail表達(dá)，從而下調(diào)E-cadherin蛋白，上調(diào)vimentin蛋白，引發(fā)如侵襲和轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)活性。但是在當(dāng)前的實驗中，并沒有采取干擾或者用抑制劑預(yù)處理細(xì)胞以進(jìn)一步驗證HGF是否通過c-Met-ERK通路調(diào)控HeLa細(xì)胞EMT進(jìn)程，而這也是該篇文章的不足，因此課題組將會在未來的研究中進(jìn)一步明確該機(jī)制。

總之，本結(jié)果表明HGF可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞 EMT 的發(fā)生，其機(jī)制可能是通過激活c-Met/MAPK/snail通路，下調(diào)E-cadherin蛋白或上調(diào)vimentin蛋白實現(xiàn)的。這提示HGF可能作為 c-Met 激活劑，而抑制c-Met的激活或表達(dá)有可能是成為抑制宮頸癌侵襲及轉(zhuǎn)移的重要舉措，而這為臨床治療宮頸癌藥物的開發(fā)提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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Hepatocyte growth factor promotes epithelial-mesenchymal transition of HeLa cells

WANG Zhi-min1,2, BAO Shan2*

(1.University of South China, Hengyang 421001; 2.Dept. of Gynaecology, People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 570100, China)

Objective To investigate the effect of HGF on epithelial-mesenchymal transition of HeLa cells. MethodsHeLa cells were treated with different concentrations of HGF(0,5,10,20 and 40 ng/mL) or incubated with HGF of same dosage(20 ng/mL) for different times(0,6,12,24 and 48 h), MTT method was used to detect cell proliferation. Migration of HeLa cells was detected by wound healing and Transwell assay; The protein expression of p-Met, E-cadherin，vimentin，snail，c-Met，p-AKT，and p-ERK were determined by Western blot.Results HGF significantly increased HeLa cells proliferation in both concentration-and time-dependent manner. Moreover, HGF promoted the migration of HeLa cells, and Western blot showed that E-cadherin was decreased，whereas vimentin was increased in HGF treated cells．Meanwhile，HGF significantly activated c-Met, and then promoted AKT, ERK activation.Conclusions HGF induces epithelial-mesenchymal transition of HeLa cell, it may up-regulate the expression of snail, and then regulate E-cadherin or vimentin expression via stimulating HGF/c-Met/MAPK or HGF/c-Met/AKT signaling.

epithelial-mesenchymal transition; hepatocyte growth factor; cervical cancer

2014- 10- 08

2014- 12- 01

海南省社會發(fā)展科技專項(SF201302)；海南省自然科學(xué)基金(30633)

1001-6325(2015)04-0485-06

R737.33

A

*通信作者(corresponding author)：baoshan3@126.com