周曉波　李 銀　楊 凌　朱 明　卞紅春

（①江蘇省鹽城市畜牧獸醫(yī)站　224000?、诮K省獸醫(yī)研究所）

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病模型的建立

周曉波①李 銀②楊 凌①朱 明①卞紅春①

（①江蘇省鹽城市畜牧獸醫(yī)站224000②江蘇省獸醫(yī)研究所）

摘要為疫苗的研究提供工具，建立鴨坦布蘇病毒病發(fā)病模型，將168只35日齡無(wú)坦布蘇病毒感染的櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分成7組，每組24只，其中1～6組分別以不同含量的鵝源坦布蘇JS804株病毒肌肉注射進(jìn)行攻毒，對(duì)照組肌肉注射相同劑量的PBS。攻毒后每天觀察臨床癥狀。分別于攻毒后2、4、6、8、13、20d每組隨機(jī)取4只攻毒鴨撲殺，分別取每只鴨各臟器樣品2份，一份放-20℃凍存，用于套式RT-PCR檢測(cè)病毒；另一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)分析和組織病理學(xué)分析。結(jié)果表明：試驗(yàn)鴨于攻毒后腿癱、頭頸扭曲、行走不穩(wěn)；各主要臟器均出現(xiàn)病變，其中以脾臟、肝臟、腦最為明顯；套氏RT-PCR，攻毒后8日各臟器病毒陽(yáng)性檢出率最高，其中以脾臟檢出率最高；由攻毒檢測(cè)結(jié)果確定鴨的攻毒量為1.6×106TCID50。腦神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死；肝細(xì)胞水泡變性、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；脾臟淋巴細(xì)胞變性、壞死。免疫組化定位發(fā)現(xiàn)：心肌纖維細(xì)胞、脾臟生發(fā)中心、肺泡上皮細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞均有棕黃色陽(yáng)性信號(hào)。本試驗(yàn)成功建立了鴨坦布蘇病毒病櫻桃谷肉鴨發(fā)病模型，為今后研制疫苗及免疫效果判定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞鴨坦布蘇病毒病發(fā)病模型免疫組織化學(xué)

從2010年4月起，我國(guó)東南水禽養(yǎng)殖大?。ㄊ?、自治區(qū)）的鴨、鵝發(fā)生一種以采食量顯著下降、產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降、具有腦炎樣神經(jīng)癥狀的傳染?。?，2］。發(fā)病的種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋率大幅下降甚至絕產(chǎn)，其死亡率為2%～15%，肉鴨、肉鵝死亡率為10%～55%，給鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病原分離、動(dòng)物回歸試驗(yàn)及基因測(cè)序分析等，已證實(shí)該病為不同于現(xiàn)有資料報(bào)道的一種新發(fā)黃病毒感染［3～7］。2011年，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆水禽疫病防控研討會(huì)將該病統(tǒng)一命名為“鴨坦布蘇病毒病”。為研究坦布蘇病毒病的發(fā)病機(jī)制和將來(lái)研制疫苗提供幫助，本試驗(yàn)開(kāi)展了鴨坦布蘇病毒病發(fā)病模型建立的研究。

1　材料與方法

1.1毒株與試驗(yàn)動(dòng)物鵝源坦布蘇病毒JS804株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所禽病研究室分離、鑒定、保存；35日齡櫻桃肉鴨購(gòu)自丹陽(yáng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)，ICR乳鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2主要試劑和儀器DNA抽提試劑盒、AMV Reverse Transcriptase、Random Primer（9mer）、rTaxDNA聚合酶及DNA marker（DL2000）購(gòu)自Takara公司；免疫組織化學(xué)所用一抗為本實(shí)驗(yàn)室保存的鼠源多抗（效價(jià)1:5000）；PBS液（0.01M，pH=7.2）、檸檬酸緩沖液（0.01M，pH=6.0）、4%多聚甲醛溶液、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、切片石蠟（56～58℃）、中性樹(shù)膠均購(gòu)自博士德生物制藥有限公司。RM2015病理切片機(jī)、徠卡HI1210攤片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠。

1.3病毒TCID的測(cè)定病毒增殖后按照殷震方法［8］50接種BHK-21細(xì)胞，測(cè)定病毒毒價(jià)。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物分組與攻毒168只35日齡無(wú)坦布蘇病毒感染的櫻桃谷肉鴨，隨機(jī)分成7組，按表1進(jìn)行攻毒。

表1　分組與攻毒情況　　　　　　 （只、ml）

隔離分開(kāi)飼養(yǎng)，攻毒后每天觀察臨床癥狀，分別于攻毒后2、4、6、8、13、20d分6批次進(jìn)行剖殺取病料，每次每組隨機(jī)抽取4只，放血處死?？焖偃∶恳唤M織器官各兩份，一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)和病理學(xué)分析；另一份放-20℃凍存，用于套式RT-PCR檢測(cè)病毒。

1.5剖檢病變觀察剖殺鴨子時(shí)注意觀察肝臟、脾臟、腦、心肌等是否有病變并進(jìn)行拍照。

1.6套式RT-PCR檢測(cè)按照RNAiso plus試劑盒說(shuō)明書(shū)要求從病料提取總RNA，參照黃欣梅等［9］的介紹合成引物，進(jìn)行套式RT-PCR。取10μl PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。

1.7主要臟器組織病理觀察將撲殺鴨各器官經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，制備石蠟切片［10］，經(jīng)蘇木精-伊紅染色［11］后鏡檢，觀察病理變化。

1.8主要臟器免疫組織化學(xué)（IHC）分析取撲殺鴨各器官經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24h以上，SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)［12，13］分析。

2　結(jié)果

2.1病毒的滴度增殖的病毒在BHK-21細(xì)胞上測(cè)定的病毒毒價(jià)為106.30TCID50/0.1ml。

2.2臨床癥狀及剖檢變化（1）臨床癥狀：第1組鴨攻毒后第2天開(kāi)始精神不振，采食量開(kāi)始下降；第6天1～5組攻毒鴨采食量均顯著下降，排白綠色糞便；第15天食量開(kāi)始恢復(fù)，白綠色糞便逐漸減少；第20天采食量等均恢復(fù)至正常水平。攻毒后第4天有輕微神經(jīng)癥狀，輕度腿癱；第8天神經(jīng)癥狀明顯，表現(xiàn)腿癱、趴臥、頭頸扭曲、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)，躺臥時(shí)兩腿向后伸展，嚴(yán)重的倒地不起；第16天神經(jīng)癥狀逐漸減輕；第20天神經(jīng)癥狀消失。攻毒鴨與對(duì)照鴨相比長(zhǎng)勢(shì)慢、體型小、瘦弱。6組沒(méi)有明顯癥狀，7組無(wú)肉眼可見(jiàn)癥狀。（2）剖檢變化：1組鴨攻毒后4d肝臟輕微腫大，邊緣輕微出血；脾臟輕微腫大，局部壞死。攻毒后6d肝臟腫大，邊緣出血；脾臟腫大，局部有小壞死灶；腿肌輕微出血；心臟外壁出血，個(gè)別心內(nèi)膜出血；腦水腫、充血。攻毒后8天脾臟斑駁似大理石樣外觀，腫大壞死，形似乒乓球；肝臟腫大呈土黃色，邊緣出血或淤血；腦膜出血，腦輕度水腫、充血、有散在的出血點(diǎn)；腿肌出血；心肌外觀蒼白，有白色條紋狀壞死，有的心臟外壁有出血，多數(shù)病例心臟內(nèi)膜出血；肺臟淤血、水腫；腎臟充血，輕微腫大；胰臟有輕微的出血或壞死點(diǎn)。2組鴨剖檢病變同1、3、4、5組病變依次減輕。6組沒(méi)有明顯病變，7組無(wú)病變。

2.3套式RT-PCR檢測(cè)（1）1組攻毒后8d套式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：具體結(jié)果見(jiàn)圖1。1組攻毒后其它時(shí)間和其它各組攻毒后套式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、3、4。（2）1組鴨撲殺后套式RT-PCR陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)情況：具體結(jié)果見(jiàn)表2。（3）各組鴨不同時(shí)間撲殺后套式RT-PCR陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果：具體結(jié)果見(jiàn)表3。（4）各組鴨不同時(shí)間撲殺后各臟器套式RT-PCR陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果：具體結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1　1組攻毒后8d各組各臟器檢測(cè)結(jié)果

表2　1組鴨撲殺后套式RT-PCR陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果　?。?）

表3　各組鴨攻毒后不同時(shí)間撲殺后套式RT-PCR陽(yáng)性率　（%）

表4　不同組鴨撲殺后各臟器套式RT-PCR陽(yáng)性率　?。?）

從表3和表4可以看出：3組在攻毒后8d檢測(cè)率高達(dá)100%，攻毒后不同時(shí)間脾臟平均檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)66.7%。2.4病理組織學(xué)變化選擇3組做組織病理學(xué)分析，主要臟器均出現(xiàn)病理病化，尤其以腦、肝臟、脾臟病變最為明顯，均出現(xiàn)了組織結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞壞死，對(duì)照組未見(jiàn)明顯病理變化。病理變化見(jiàn)圖2。

圖2　病理組織學(xué)觀察結(jié)果（HE染色× 400）

2.5免疫組織化學(xué)分析選擇攻毒組3組進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，在心臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦組織均發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，尤其以脾臟、腦組織內(nèi)居多。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　免疫組化分析結(jié)果（IHC染色×400）

3　討論

（1）鴨坦布蘇病毒是流行于我國(guó)的一種新型黃病毒病，從2010年4月起發(fā)生在我國(guó)東南部，迅速蔓延至我國(guó)主要養(yǎng)鴨省市包括浙江、江蘇、江西北京、湖北等［2-5，14-16］地，給養(yǎng)鵝、養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。（2）本研究選擇35日齡櫻桃谷肉鴨，腿肌肌肉注射鵝黃病毒JS804毒株。通過(guò)臨床癥狀、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等方面來(lái)研究攻毒模型。臨床癥狀表明攻毒劑量越大的組癥狀越嚴(yán)重；臨床剖檢也是攻毒劑量越大的組眼觀病變?cè)絿?yán)重；套氏RT-PCR攻毒劑量越大的組，各個(gè)組織器官檢測(cè)率更高。此結(jié)果相一致，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，攻毒劑量的高低同發(fā)病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。（3）攻毒組3組（1.6× 106TCID50）試驗(yàn)鴨，臨床出現(xiàn)腿癱、排白綠色糞便、行走不穩(wěn)等癥狀；剖檢各主要臟器可見(jiàn)眼觀病變，尤以脾臟明顯；套式RT-PCR檢測(cè)是陽(yáng)性，第8天脾臟檢測(cè)率最高；組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)脾臟、肝臟、腦等臟器病變嚴(yán)重；免疫組織化學(xué)分析，脾臟、腦組織陽(yáng)性細(xì)胞居多。所以，臨床、剖檢、套式RT-PCR、病理組織學(xué)、免疫組織化學(xué)均表明：本試驗(yàn)已成功建立了鴨坦布蘇病毒發(fā)病模型，即34日齡櫻桃谷肉鴨的攻毒量是1.6×106TCID50，攻毒后8d發(fā)病最嚴(yán)重，脾臟檢測(cè)率最高。

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病模型的成功建立，為今后坦布蘇病毒病疫苗的研制和免疫效果的判定奠定了基礎(chǔ)。

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中圖分類號(hào)：S858.293

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2015）02-0005-03

收稿日期：（2014-11-20）