才 松

（青海省曲麻萊縣巴干鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站 815500）

乳酸菌為可發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的一類細菌的統(tǒng)稱，并是一種動物體內(nèi)的重要益生菌。乳酸菌有助于改善機體胃腸免疫機能，并幫助機體生成維生素與正常排便，對于人畜的健康有積極作用[1]。藏綿羊主要生活在我國青藏高原地區(qū)，那里的平均海拔超過三千米，常年嚴寒且空氣稀薄。而在這樣惡劣的生存環(huán)境下，藏綿羊具有很強的適應(yīng)能力，并且是高原牧民日常生活中常見的畜種。由于藏綿羊多為自然放養(yǎng)且生活環(huán)境惡劣，因此高原地區(qū)藏綿羊一般體形偏小，且很容易被多種疾病感染，如羊犢腹瀉就是高原牧區(qū)流傳較廣的疾病。本次研究選擇十頭藏綿羊的糞便，在分離和細菌培養(yǎng)后進行提純處理，探究藏綿羊腸道乳酸菌的生物學特性以及構(gòu)成，以此為開發(fā)藏綿羊腹瀉治療藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1采集樣品

選擇生活于若爾蓋草原的健康藏綿羊十頭，這些藏綿羊均為天然放牧，生長發(fā)育情況良好。在無菌情況下采集這些藏綿羊的新鮮糞便，并且放置于試管中并滴注MRS液體進行培養(yǎng)，然后在實驗室中進行進一步操作。

1.2分離與提純

在含有碳酸鈣的MRS平板上涂布含有糞便的液體培養(yǎng)基，然后置于三十攝氏度下進行培養(yǎng)，并在二十四小時候再一次涂布，保障菌群的正常生長。在培養(yǎng)過程中定時觀察菌群的生長情況與特性，并且選擇其中形態(tài)較小的菌落進行生化試驗，并在革蘭氏染色鏡下進行檢查。將經(jīng)過氧化氫酶檢驗呈現(xiàn)陰性，以及經(jīng)革蘭氏染色呈現(xiàn)陽性的分離出來，然后置于MRS平板進行再次培養(yǎng)。在恒溫情況下培養(yǎng)24小時候再次進行分離，重復多次以達到純化的目的。在鏡檢表明菌落形態(tài)一致后，將這些乳酸菌菌株再次進行培養(yǎng)，并在24小時候后進行甘油保種，以此增加菌株數(shù)量。

1.3 DNA序列擴增

將對數(shù)期的菌液進行高速離心，然后得到其中的菌株提取出DNA序列，并加入適當?shù)囊镞M行DNA擴增。最后通過凝膠電泳法對所得序列進行檢測，判斷這些片段是否正確，并收集正確的DNA片段進行測序。

1.4分子鑒定與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已有DNA序列進行對比，在確定乳酸菌菌株所屬類別的同時，對所得序列進行對比，然后使用相關(guān)軟件繪制菌株系統(tǒng)進化樹，進而了解藏綿羊腸道乳酸菌的生物學特性以及進化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1革蘭氏染色檢驗情況

在分離并提純?nèi)樗峋旰?，?0個樣本中得到15株乳酸菌單菌，而在革蘭氏染色鏡檢下發(fā)現(xiàn)均為陽性，且菌株呈現(xiàn)桿形或球形，為長鏈狀或短鏈狀排列，沒有芽孢或鞭毛。

2.2 DNA擴增情況

通過對分離得到的15株乳酸菌單菌進行DNA序列測定，發(fā)現(xiàn)分屬菌株類別有六個，分別為海氏腸球菌、植物乳桿菌、馬蹄鏈球菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌以及巴氏鏈球菌。

2.3菌株遺傳特性分析

根據(jù)DNA序列表進行對比后構(gòu)建DNA序列的進化樹，結(jié)果表明：海氏腸球菌為2株，植物乳桿菌為4株，馬蹄鏈球菌2株，鶉雞腸球菌2株，糞腸球菌3株，巴氏鏈球菌2株，可見所得均為乳酸菌菌株。

3 討論

藏綿羊為我國珍貴的原始綿羊品種，常年生活在海拔超過三千米的青藏高原地區(qū)。由于高原地區(qū)常年嚴寒且空氣稀薄，并且藏綿羊多以自然放養(yǎng)為主。因此在這樣惡劣的生存環(huán)境下，藏綿羊免疫力較低且體形偏小，很容易被多種疾病感染。近年來，高原地區(qū)藏綿羊發(fā)生腹瀉的概率升高，這也給牧民帶來嚴重的經(jīng)濟損失[2]。雖然抗生素等藥物的應(yīng)用能夠治療動物腹瀉等疾病，并在個體疾病方面也有較好的效果。但是抗生素具有一定的耐藥性，且容易導致環(huán)境污染并存在藥物殘留，而如何更好地預防藏綿羊等動物腹瀉引起了多方面的關(guān)注。由于藏綿羊的生存環(huán)境特殊，且為綠色無污染食品，如何減少抗生素使用的不利影響，這是當前研究的重點。而乳酸菌作為動物體內(nèi)的重要益生菌，對于改善機體胃腸免疫機能，保障動物健康有積極作用。因此，開發(fā)藏綿羊乳酸菌制劑是重要的研究方向。

本次研究通過采集了十頭藏綿羊的糞便，在分離和細菌培養(yǎng)后進行提純處理，從中得到乳酸菌株并進行分子鑒定。結(jié)果表明，得到乳酸菌單菌中所占比例較多的為植物乳桿菌、糞腸球菌等，另外也包括馬蹄鏈球菌、鶉雞腸球菌以及巴氏鏈球菌等。鶉雞腸球菌為人畜體內(nèi)的重要菌體，并且可以產(chǎn)生腸球菌素，進而起到抑菌的作用，促進宿主的腸道健康。而海氏腸球菌與糞腸球菌等為動物腸道內(nèi)的正常菌群，能夠抑制細菌的生長和繁殖，進而保障機體的正常消化功能。而植物乳桿菌這種多見于蔬菜、植物等發(fā)酵制品中的乳酸菌，對于維護腸道的正常消化吸收有重要作用[3]。而本次研究所占比例較高，與藏綿羊食用草類植物較多有一定的關(guān)系，并且需要進一步驗證。綜上所述，本次研究對于了解藏綿羊腸道的乳酸菌組成，并開發(fā)相應(yīng)的乳酸菌制劑有一定的參考作用。

[1]王欣榮,吳建平.藏羊腦動脈系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特征與高原適應(yīng)性研究[J].家畜生態(tài)學報,2013(08).

[2]張冰,張煥容,湯承,王永.藏系綿羊源沙門菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的分離與PCR鑒定[J].動物醫(yī)學進展,2013(04).

[3]張雪峰,楊應(yīng)忠,裴志偉.藏羚羊和藏系綿羊血液內(nèi)分泌激素水平的比較研究[J].生理學報,2011(04).