馬步芳，孫立權(quán)，張夢南，姚國偉，羅愛芹

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

克拉霉素（CAM, clarithromycin）于上世紀(jì)90年代由日本大正制藥株式會社發(fā)現(xiàn)、由美國雅培公司開發(fā)成功的一種半合成抗生素[1～3]，其抗菌活性強、藥代動力學(xué)性能好[4]，能夠治療幽門螺旋桿菌引起的胃潰瘍而成為了臨床上不可或缺的藥物[5]，已經(jīng)進入我國基本藥物目錄[6]。隨著檢測技術(shù)水平的提高，該藥物的藥典標(biāo)準(zhǔn)也在逐步提高。克拉霉是以紅霉素A經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾而得到的[7,8]，由于結(jié)構(gòu)的相似性，原料紅霉素A的雜質(zhì)、合成過程的中間體、反應(yīng)的副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物等都可能成為克拉霉素雜質(zhì)而影響其質(zhì)量[9]。某些雜質(zhì)在生產(chǎn)過程中難以除去而殘留在克拉霉素中，被稱作克拉霉素相關(guān)物（Relative substances），其種類和含量是反映藥物安全性和純度的直接指標(biāo)[10]。歐洲藥典為例[11]規(guī)定了16種相關(guān)物作為克拉霉素質(zhì)量控制的對象，其中3-O-去克拉定糖-6-O-甲基紅霉素A (I)，紅霉素A 9-肟 (J)，3’-N-去甲基-6-O-甲基紅霉素A(E)9-肟 (M)，6-O-甲基紅霉素A(E)9-肟(C) 和3’-N-去甲基-6-O-甲基紅霉素A (D)等5種相關(guān)物（結(jié)構(gòu)見圖1）均是生產(chǎn)過程中常見的中間體和降解產(chǎn)物，在我國生產(chǎn)的克拉霉素中較為常見，應(yīng)該成為我國藥典標(biāo)準(zhǔn)克拉霉素質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

在克拉霉素藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，歐洲藥典和美國藥典[12]采用梯度洗脫的高效液相色譜法對克拉霉素進行分析檢測，并對相關(guān)物的種類和各相關(guān)物的含量加以控制；中國藥典2015版[13]僅要求控制單個雜質(zhì)峰含量和雜質(zhì)總量，而對相關(guān)物的種類和各相關(guān)物含量沒有要求。我國藥典與歐美藥典的質(zhì)量控制的差距不利于我國克拉霉素產(chǎn)品走向國際市場，且國內(nèi)用藥安全也不能得到保證。這是由于我國還不能提供在克拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量控制中需要的相關(guān)物。報道中[14]，從歐洲藥典委員會購買的克拉霉素對照品按照歐洲藥典的方法進行檢測，但此對照品中不含有J、M、N和K等4種相關(guān)物。從歐洲藥典委員會購買標(biāo)準(zhǔn)對照品價格非常昂貴，難以實現(xiàn)各質(zhì)量控制部門均得到此標(biāo)準(zhǔn)對照品。本研究將I、J、M、C和D等5種相關(guān)物與克拉霉素的混合樣品采用高效液相色譜法進行檢測，并對分析檢測方法進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

HPLC體系由溶劑輸送泵（LC-10AT，島津公司）、柱溫箱（CTO-10AS，島津公司）和紫外檢測器（SPD-10A，島津公司）組成；色譜柱為Purospher STAR LP RP-18e(250mm×4.6mm，5um，德國默克公司)型C18柱。

克拉霉素相關(guān)物對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；I（92.75%）， J（94.86%）， M（95.78%）， C（96.86%），D（97.33%）和克拉霉素（92.37%）對照品均為本課題組合成并且已經(jīng)過已通過1H-NMR、13C-NMR和MS驗證；HPLC所用的甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

流動相采用0.067mol/L KH2PO4溶液（pH 4.0）/乙腈=64/36；流速為0.7 ml/min；柱溫為35℃；檢測波長選用210nm；進樣量為20ul。

1.3 溶液配制

克拉霉素相關(guān)物儲備液：準(zhǔn)確稱取克拉霉素相關(guān)物對照品50.0mg，用流動相溶解并定容至5ml，于4℃冰箱中保存。

克拉霉素相關(guān)物標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取克拉霉素相關(guān)物儲備液1.5ml，用流動相稀釋定容至5ml，室溫避光放置。

線性試驗系列溶液：準(zhǔn)確稱取I、J、M、C和D各2.0mg混合后以流動相溶解并定容至10ml，再依次稀釋為各相關(guān)物濃度均為160, 120, 80, 40和20ug/ml的系列溶液，室溫避光放置。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種克拉霉素相關(guān)物雜質(zhì)分析條件研究

2.1.1樣品溶劑的影響

樣品溶劑對色譜峰的峰形有一定影響。本實驗選取了乙腈、甲醇和流動相作為溶劑對克拉霉素相關(guān)物樣品進行溶解后進樣洗脫，所得分離結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明在以乙腈為溶劑時，各相關(guān)物峰出現(xiàn)前沿現(xiàn)象，這可能是由于乙腈的非極性對于樣品的溶解度強于流動相，當(dāng)進樣溶劑與流動相混合時，一部分分子會先與流動相混合，致使這些分子通過色譜柱的速度發(fā)生變化，使峰形扭曲，發(fā)生變形；以甲醇和流動相未溶劑時各組分峰形良好，但以甲醇為溶劑時譜圖中會出現(xiàn)較多的雜峰對實驗結(jié)果造成干擾，因此本研究選擇流動相為溶劑對樣品進行溶解和稀釋。

2.1.2方法適應(yīng)性研究

采用1.2項的色譜條件對克拉霉素相關(guān)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，各相關(guān)物與克拉霉素都能夠完全分離，（色譜圖如圖3所示）；相關(guān)物D的峰高與D和克拉霉素峰之間的峰谷到基線的高度之比大于3，符合系統(tǒng)適用性的要求。在此色譜條件下，I、J、M、C和D的相對保留時間（克拉霉素的保留時間為14.6min）分別為0.41min、0.55min、0.75min、0.84min和0.92min；各組分能夠完全分離，分離度均大于1.0。

2.2 分析方法的驗證

2.2.1精密度試驗

取克拉霉素相關(guān)物標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2項的色譜條件進行洗脫，重復(fù)進樣6次并記錄各相關(guān)物峰面積。計算得I、J、M、C、D和克拉霉素的RSD分別為1.86%、0.48%、1.84%、0.97%、0.94和1.00%，均小于2.0%，符合精密度要求。

2.2.2穩(wěn)定性試驗

取克拉霉素相關(guān)物對照品15.0mg，以流動相溶解并定容至5ml，混勻后室溫避光放置。按照1.2的色譜條件于0、2、4、6和8h分別進樣洗脫并記錄各物質(zhì)的峰面積。計算所得I、J、M、C、D和克拉霉素的RSD分別為1.09%、1.52%、1.95%、1.63%、1.20和1.21%，均小于2.0%，表明在室溫避光的條件下放置時克拉霉素相關(guān)物標(biāo)準(zhǔn)溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3線性關(guān)系

將線性試驗系列溶液分別按照1.2項的色譜條件進行洗脫并記錄各相關(guān)物峰面積。以各相關(guān)物濃度（ug/ml）為x，峰面積為y計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（如表1所示），結(jié)果表明在20～200ug/ml范圍內(nèi)，各相關(guān)物濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.4準(zhǔn)確度試驗

加標(biāo)回收率的測定是常用的確定準(zhǔn)確度的方法之一，也是在樣品測定時質(zhì)量控制的主要方法。以克拉霉素為空白基質(zhì)分別加入5種相關(guān)物，使每種相關(guān)物終濃度均為60、120、180ug/ml三個水平并按照1.2項的色譜條件進行洗脫，每個濃度重復(fù)進樣3次，分別記錄5種相關(guān)物的峰面積并計算回收率和精密度（見表2）。所得的各濃度條件下每種相關(guān)物的平均回收率均在102.13～110.39%之間，精密度均小于1.82%。

3 結(jié)論

本研究將采用高效液相色譜法對克拉霉素相關(guān)物對照品進行了分離，采用0.067mol/L KH2PO4溶液（pH4.0）/乙腈=64/36為流動相、流速0.7ml/min檢測波長210nm、溫度35℃的色譜條件，以等度洗脫的方式在25min內(nèi)能夠完全分離混合物中的各物質(zhì)，簡化了分析方法，降低了分析設(shè)備的要求。該方法的精密度試驗中各組分峰峰面積的RSD均小于1.86%、穩(wěn)定性試驗中各組分峰峰面積的RSD均小于1.95%；各相關(guān)物在20～200ug/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999），平均回收率在102.13 ～110.39%范圍內(nèi)，所得結(jié)果均符合方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。此方法簡便高效，可用于克拉霉素中I、J、M、C和D五種相關(guān)物的同時分離和檢測，能夠為克拉霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供一定的技術(shù)支持。

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