覃茂昌，鄭暉，胡志遠(yuǎn)，李勤1

（1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2. 國(guó)家納米科學(xué)中心,納米生物效應(yīng)與安全性研究室, 北京 100190；3. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所,活體分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190；4. 長(zhǎng)三角（嘉興）納米科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，浙江嘉興 314000）

類肽（peptoid）是以N-取代甘氨酸為單元，與多肽結(jié)構(gòu)相似的非天然折疊體[1,2]。它可以折疊成高生物活性[3,4]和高特異性的功能單元[5]，且其組成單元比多肽更豐富[6]，并能夠耐受蛋白酶[7]，因此近年有關(guān)類肽的研究日益增長(zhǎng)，它也在生物和醫(yī)學(xué)上有廣泛的應(yīng)用[8,9]。經(jīng)過(guò)良好設(shè)計(jì)，類肽還可以形成高度有序的超分子納米片層[10]，甚至形成具有宏觀尺度的納米平面材料[11,12]，從而具有眾多應(yīng)用前景，例如可能發(fā)展為具有類似蛋白活性的分子識(shí)別和催化的功能材料[9]。

盡管二維類肽納米材料在生物和醫(yī)學(xué)研究上具有重要意義[13,17,18]，精確合成這樣的材料仍有很大困難。Zuckermann團(tuán)隊(duì)用朗繆爾槽和Wilhemy平板裝置測(cè)量了類肽溶液氣-液表面界面壓縮和表面張力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)類肽納米片層的形成所遵守的機(jī)制[14～16]。實(shí)驗(yàn)表明，兩親性類肽分子在氣-液表面自組裝形成單分子層，這樣的單分子層在界面壓縮作用下向液面塌陷，形成穩(wěn)定的類肽雙分子層結(jié)構(gòu)，疏水部分朝向雙分子層內(nèi)側(cè)，親水部分暴露在外。由于其縱向厚度在納米量級(jí)，這些類肽雙分子層又被稱作類肽納米片層（peptoid nanosheet）。雖然朗繆爾槽可以用于制備類肽納米片層材料，但存在一些明顯不足。如其中的溶液容易蒸發(fā)且易被污染，并且該設(shè)備尺寸較大、造價(jià)較為昂貴且原料消耗較大，但長(zhǎng)鏈類肽合成成本較高，因此使用朗繆爾槽作為反應(yīng)器非常不經(jīng)濟(jì)，需要開發(fā)更經(jīng)濟(jì)更簡(jiǎn)便的專用方法和專用設(shè)備。

本研究開發(fā)了一種小型合成儀器，利用類肽溶液氣-液表面積的周期性的壓縮，以達(dá)到模擬朗繆爾槽的施力過(guò)程，從而能夠形成穩(wěn)定的類肽納米片層。每個(gè)反應(yīng)均在各自的反應(yīng)瓶中進(jìn)行，大大減少了類肽原材料的耗費(fèi)，且一次運(yùn)行可以合成最多40種類肽納米片層，從而實(shí)現(xiàn)類肽納米片層的自動(dòng)化、高通量制備。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 類肽分子的合成

本文采用了微調(diào)條件后的固相亞單元法進(jìn)行類肽的合成[18]，將負(fù)載量0.30mmol/g的Rink amide AM樹脂（吉爾生化，中國(guó)）加入50mL多肽合成管中，后加入2M溴乙酸（98%，Alfa Aesar，中國(guó)）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（99.5%，北京化工廠，中國(guó)）溶液（3.2M N，N-二異丙基碳二亞胺（DIC）（99%，Alfa Aesar，中國(guó)）為縮合劑）?；瘶渲┒说陌被?7攝氏度條件下反應(yīng)30min。再加入2M伯胺在37攝氏度反應(yīng)90min以取代掉溴。通過(guò)重復(fù)上述步驟完成分子的合成，在合成完成后通過(guò)95%三氟乙酸（TFA）（99%，aladdin，中國(guó)），2.5%的超純水和2.5%三異丙基硅烷（Tips）（98%，Acros，比利時(shí)）反應(yīng)2h將類肽從樹脂上裂解下來(lái)并移出側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，經(jīng)過(guò)稀釋并凍干后用高效相色譜（HPLC）（E2695,Waters,美國(guó)）純化并用質(zhì)譜（MS）（H-CLASS,Waters,美國(guó)）進(jìn)行鑒定。

1.2 類肽納米片層的合成

取適量干粉類肽溶于比例為2:1的二甲基亞砜（DMSO）（99.5%，Sun，中國(guó)）與超純水的混合液中，使其形成2mM的類肽母液。取5μL的功能類肽母液加入895μL的超純水與100μL的緩沖液配制形成10μM的功能類肽納米片合成液。緩沖液是由10mM的三羥甲基氨基甲烷（Tis-HCl）（Solarbio，中國(guó)）和100mM的氯化鈉（NaCl）（99.5%，北京化工廠，中國(guó)）組成，此環(huán)境下緩沖液的PH值為8.0。

用移液槍取1mL類肽納米片合成液移到反應(yīng)瓶中，置反應(yīng)瓶于載物臺(tái)上。設(shè)定軟件控制載物臺(tái)的正轉(zhuǎn)停留角度為90°、反轉(zhuǎn)停留角度為4.5°、正轉(zhuǎn)停頓時(shí)間為0、反轉(zhuǎn)停頓時(shí)間為450s、總回合數(shù)為200（運(yùn)行時(shí)間大約為24h）以及正反旋轉(zhuǎn)速率為0.4rpm，運(yùn)行超低速類肽納米片層合成儀器。

1.3 基于熒光顯微鏡類肽納米片層的表征

用移液槍取10μL的100μM的尼羅紅（Nile Red）（95%，Solarbio，中國(guó)）染料，加入到用超低速類肽納米片層合成儀制備結(jié)束后的反應(yīng)瓶中染色類肽納米片層5min，再取2μL染色后的類肽納米片層溶液移到厚度大約為3-4mm的1%的瓊脂糖（agarose）透明基片上，置于倒置熒光顯微鏡（AxiO Vert.AI）下，紅色熒光通道觀察類肽納米片層合成結(jié)果（圖4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 類肽分子序列的設(shè)計(jì)

用于類肽納米片層制備的類肽分子必須具備兩親性。所設(shè)計(jì)的類肽分子是由親水部分的氨基、羧基和疏水部分的苯環(huán)三個(gè)部分所組成的28個(gè)序列類肽（圖1 a）。

由類肽分子形成納米片層結(jié)構(gòu)的原理如下圖1的b所示。反應(yīng)瓶水平放置，使得類肽溶液氣-液界面面積充分大，靜置類肽溶液后，類肽分子通過(guò)親水性和疏水性的相互作用，在溶液界面形成親水部分為液面下、疏水部分為液面上的自由分子層。接著通過(guò)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)瓶，使溶液界面面積縮小，類肽分子之間通過(guò)電荷相互作用在溶液界面形成致密分子層。繼續(xù)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)瓶，壓縮溶液界面面積，類肽分子帶氨基和羧基的親水部分在界面壓縮的作用下，會(huì)包裹疏水部分的苯環(huán)在液相形成納米片層結(jié)構(gòu)。

2.2 超低速類肽納米片層合成儀的設(shè)計(jì)

超低速類肽納米片層合成儀的設(shè)計(jì)原理正是通過(guò)壓縮兩親性類肽溶液的界面面積，使類肽分子的親水部分暴露在外側(cè)，疏水部分包裹在內(nèi)側(cè)，形成穩(wěn)定的類肽納米片層。

通過(guò)周期性地改變類肽溶液的表面積，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)界面溶液的規(guī)律性擠壓，從而促進(jìn)形成納米片層?；谶@一想法，我們對(duì)反應(yīng)瓶中液體的表面積變化建立了模型，并加以分析。

假設(shè)反應(yīng)瓶（內(nèi)徑為1cm、高為3.5cm的圓柱體玻璃瓶）所加的類肽溶液不超過(guò)其體積的一半，則其從水平位置旋轉(zhuǎn)到垂直位置溶液界面面積需經(jīng)過(guò)的不同的四種狀態(tài)（圖2 (a)中的a、b、c、d）。此時(shí)，反應(yīng)瓶中溶液界面面積分別經(jīng)過(guò)三個(gè)變化過(guò)程（圖2 (a)中的e、f、g）。反應(yīng)瓶中溶液界面面積的變化與反應(yīng)瓶旋轉(zhuǎn)角度之間的關(guān)系對(duì)應(yīng)于如下的公式1。

對(duì)公式1用MATLAB擬合分析，反應(yīng)瓶從水平位置旋轉(zhuǎn)到垂直位置，當(dāng)其旋轉(zhuǎn)角度從初始狀態(tài)的4.5°變化到90°時(shí)，類肽溶液界面面積縮小為初始狀態(tài)的24%(圖2 b)。借助自動(dòng)化手段，使反應(yīng)瓶以一個(gè)慢的角速度（小于1rpm）進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)，則能實(shí)現(xiàn)形成類肽納米片層結(jié)構(gòu)所需的類肽溶液氣-液界面面積壓縮過(guò)程。

在利用朗繆爾槽實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行類肽納米片層制備時(shí)，需要以100cm2/min的速率壓縮10μM濃度的類肽溶液的兩相界面，使其表面積從80cm2被擠壓到20cm2，即界面面積縮小為原面積的1/4需要用36s。對(duì)應(yīng)于在上述模型，反應(yīng)瓶從初始狀態(tài)的4.5°旋轉(zhuǎn)到90°時(shí)，類肽溶液界面面積縮小為初始狀態(tài)的24%，這個(gè)過(guò)程需要38s，即反應(yīng)瓶約以0.4rpm的角速度旋轉(zhuǎn)4.5°到90°。

經(jīng)過(guò)以上分析，利用自動(dòng)化設(shè)備控制反應(yīng)瓶旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行類肽納米片層的制備是可行的。本文專門設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的類肽納米片層合成儀器——超低速類肽納米片層合成儀器（圖3）。該設(shè)備較為小巧，可以取代價(jià)格昂貴、體積較大的朗繆爾槽，用于小量類肽納米片層的高通量、快速制備。

本類肽納米片層合成儀由載物臺(tái)、驅(qū)動(dòng)單元、控制單元和固定單元構(gòu)成，其中驅(qū)動(dòng)單元包括直流電機(jī)、蝸輪蝸桿減速裝置、同步帶輪及傳送帶，而控制單元主要有增量式光電編碼器、光電開關(guān)、電路板和控制軟件。載物臺(tái)、驅(qū)動(dòng)單元和控制單元通過(guò)固定單元的轉(zhuǎn)接件相互固定連接，從而形成一體化、自動(dòng)化的類肽納米片層合成儀器（圖3 a）。

類肽納米片層合成儀器的驅(qū)動(dòng)單元通過(guò)與蝸輪蝸桿減速裝置固定連接的直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)同步帶輪旋轉(zhuǎn)的方式，穩(wěn)定帶動(dòng)載物臺(tái)的低速旋轉(zhuǎn)，間接的實(shí)現(xiàn)反應(yīng)瓶中溶液界面面積的變化。并且載物臺(tái)可以放置40個(gè)反應(yīng)瓶，實(shí)現(xiàn)類肽納米片層的高通量制備（圖3 a,b）。

與此同時(shí)，載物臺(tái)的旋轉(zhuǎn)過(guò)程又被控制單元的光電開關(guān)和增量式光電編碼器反饋出其所在的位置和旋轉(zhuǎn)的角度，使控制單元可以通過(guò)電路板和上位機(jī)控制軟件自動(dòng)化的控制載物臺(tái)的正反轉(zhuǎn)的速率、角度、停頓時(shí)間和總運(yùn)行時(shí)間，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)控其運(yùn)行狀態(tài)（圖3 c）。從而實(shí)現(xiàn)類肽納米片層的自動(dòng)化制備。

本類肽納米片層合成儀所能實(shí)現(xiàn)的穩(wěn)定帶動(dòng)反應(yīng)瓶低速度旋轉(zhuǎn)的程度主要由驅(qū)動(dòng)單元的直流電機(jī)、蝸輪蝸桿減速裝置和同步帶輪以及控制單元的電路板電路及控制程序決定。該儀器采用與蝸輪蝸桿減速裝置固定連接輸出額定轉(zhuǎn)速為3rpm、轉(zhuǎn)矩為3N·m的直流電機(jī)，通過(guò)2:1的同步帶輪減速，使其能穩(wěn)定帶動(dòng)載物臺(tái)以1.5rpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)。載物臺(tái)的進(jìn)一步減速由電路板的PWM驅(qū)動(dòng)程序?qū)崿F(xiàn)，并且經(jīng)測(cè)試本類肽納米片層合成儀器能穩(wěn)定的帶動(dòng)載物臺(tái)的實(shí)際轉(zhuǎn)速范圍為0.24～1.12rpm（圖2 c），使其可以滿足反應(yīng)瓶制備類肽納米片層所需要的超低速速率。

2.3 類肽納米片層的制備

利用所研制超低速類肽納米片層合成儀，進(jìn)行了類肽納米片層的制備。經(jīng)尼羅紅染色后熒光顯微鏡下觀察，儀器制備的肽納米片層面積大（約30μm*100μm）、邊緣平滑清晰（圖4）與朗繆爾槽試驗(yàn)裝置制備結(jié)果比較達(dá)到了相近的效果。

2.4 利用類肽納米片層合成儀制備類肽納米片層條件的優(yōu)化

由于類肽納米片層的自組裝主要在溶液的氣-液界面進(jìn)行，因此，除了類肽分子的自身性質(zhì)和溶液濃度外，類肽分子能否在溶液界面達(dá)到穩(wěn)定，以及所施加界面壓力大小是否適合，是影響納米片層制備的主要因素。因此，我們摸索了載物臺(tái)的旋轉(zhuǎn)速率和每回合的停頓時(shí)間對(duì)類肽納米片層制備效果的影響（表1）。

類肽納米片層合成儀器載物臺(tái)以0.3rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時(shí)，類肽溶液界面面積縮小為初始狀態(tài)的24%需要47.5s。此時(shí)，儀器能提供的界面壓力過(guò)小，每次壓縮結(jié)束后，不管溶液在界面面積最大處?kù)o置時(shí)間多長(zhǎng)，都無(wú)法形成類肽納米片層（圖5 a、b、c）。

增大載物臺(tái)旋轉(zhuǎn)速率到0.4rpm時(shí)，類肽溶液界面面積在35.6s內(nèi)被壓縮到初始狀態(tài)的24%。此時(shí)，設(shè)置反應(yīng)瓶在4°位置靜止225s，類肽溶液在界面面積最大處?kù)o置的時(shí)間較小，所形成的類肽納米片層也相應(yīng)較?。▓D5 d）。提高靜置時(shí)間到450s，較多的類肽分子在溶液界面形成單分子層，壓縮界面后形成的類肽納米片層大且規(guī)整（圖5 e）。繼續(xù)提高靜置時(shí)間到900s，此時(shí)，靜置過(guò)程中一定量的納米片層由于重力作用會(huì)下沉到液面下，在再擠壓的過(guò)程中所形成的類肽納米片層易折疊和重合（圖5 f）。

繼續(xù)增大超低速類肽納米片層合成儀器載物臺(tái)的旋轉(zhuǎn)速率，使其以0.9rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，溶液界面面積從最大壓縮到最小只需要15.8s。此時(shí)儀器對(duì)類肽溶液界面施加的表面壓力過(guò)大，所形成的類肽納米片層易重合和折疊（圖5 g、h、i）。

3 結(jié)論

目前，類肽的研究正在迅速地發(fā)展，對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能的研究也在不斷深入。類肽分子經(jīng)自組裝成高級(jí)結(jié)構(gòu)后，可以修飾其他功能基團(tuán)或分子標(biāo)記，用于分子識(shí)別、催化、傳感器等方面的研究，在生物化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域有廣闊前景。本文所設(shè)計(jì)的小型化的超低速類肽納米片合成儀器，可以自動(dòng)化、高通量的制備類肽納米片層，與朗繆爾槽實(shí)驗(yàn)裝置相比，具有體積小、速度快、消耗樣品少等優(yōu)點(diǎn)，從而為類肽研究提供有力的工具。此外，對(duì)于其它很多具有兩親性的分子而言，本儀器也有望作為一種通用的兩維材料制備工具。

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