袁 林，查鋒超，姚 燁，韓凱寧，劉 敏，董士遠(yuǎn)（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 水產(chǎn)品高值化利用實(shí)驗(yàn)室，山東 青島　266003）

牡蠣酶解產(chǎn)物與還原糖美拉德反應(yīng)工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

袁 林，查鋒超，姚 燁，韓凱寧，劉 敏，董士遠(yuǎn)*
（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 水產(chǎn)品高值化利用實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003）

目的：對(duì)影響牡蠣酶解產(chǎn)物與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products of oyster enzymatic hydrolysates and reducing sugar，MRPs-OEH）風(fēng)味的因素進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的美拉德反應(yīng)條件，并對(duì)其風(fēng)味進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：以感官評(píng)分為指標(biāo)，通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化牡蠣酶解產(chǎn)物與還原糖的美拉德反應(yīng)條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)工藝參數(shù)，采用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)新鮮牡蠣（fresh oyster，F(xiàn)O）、牡蠣酶解產(chǎn)物（oyster enzymatic hydrolysates，OEH）和最優(yōu)工藝條件下制備的牡蠣美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（optimal Maillard reaction products of oyster enzymatic hydrolysates and reducing sugar，OMRPs-OEH）的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較分析。結(jié)果：牡蠣酶解產(chǎn)物與還原糖美拉德反應(yīng)的最適條件為反應(yīng)時(shí)間29.43 min、反應(yīng)溫度114.62 ℃、反應(yīng)初始pH 6.97、OEH與還原糖（木糖-葡萄糖質(zhì)量比2∶1）質(zhì)量比1∶1，在此條件下MRPs-OEH的綜合感官評(píng)分為20.88，和預(yù)測(cè)值20.25比，相對(duì)誤差約為3.08%。進(jìn)一步用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)FO、OEH和OMRPs-OEH的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，分別檢出30、36 種和45 種風(fēng)味化合物。OEH中的主要揮發(fā)性成分如癸醛、壬醛、正辛醛、（Z）-2-癸烯醛等，使牡蠣酶解液呈現(xiàn)出腥味、哈喇味和油脂味，經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，主要揮發(fā)性成分變成二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、（Z）-4-庚烯醛等，它們綜合體現(xiàn)了OMRPs-OEH的貝香味、肉香味和海鮮味，同時(shí)產(chǎn)生了一些吡嗪類物質(zhì)，賦予了其一些堅(jiān)果-肉香味。結(jié)論：美拉德反應(yīng)不僅改善了牡蠣酶解產(chǎn)物的風(fēng)味，也為新型牡蠣調(diào)味品的開發(fā)提供了依據(jù)，具有極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

牡蠣；美拉德；響應(yīng)面；電子鼻；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用.

spectrometry （GC-MS）

牡礪是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，它肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，被稱為“海洋牛奶”，牡礪肉中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于牛乳和人乳［1］，同時(shí)因?yàn)樗缓；撬?，所以又有著?dú)特的藥用價(jià)值［2］。但是，研究［3-4］表明，由于酶解過程中牡蠣脂質(zhì)的氧化降解以及蛋白質(zhì)降解，使得牡蠣酶解液的腥苦味較重，風(fēng)味較差，影響食用。美拉德反應(yīng)是非酶促褐變反應(yīng)之一，主要是指羰基化合物（如葡萄糖）和氨基化合物（如氨、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等）之間進(jìn)行的一類氨基羰基的加成、縮合、環(huán)化和聚合等的非酶促反應(yīng)，又稱羰胺反應(yīng)，它能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味和色澤［5］。張陸霞等［6］以鱈魚排為原料，添加木糖、葡萄糖，在110 ℃加熱90 min，制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有醇厚的海鮮風(fēng)味；鄭捷等［7］以蝦下腳料為原料，采用風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶1∶1復(fù)合，酶解后，以酶解液為原料，在pH 7.0、溫度110 ℃條件下反應(yīng)30 min，再經(jīng)過與其他輔料調(diào)配，得到的復(fù)合調(diào)味料香味濃郁，蝦味鮮美。然而，利用美拉德反應(yīng)制備牡蠣風(fēng)味調(diào)味品的研究還比較少，且美拉德反應(yīng)受較多因素的影響，反應(yīng)體系的pH值、溫度、加熱時(shí)間、各種物質(zhì)的添加量都會(huì)對(duì)香味產(chǎn)生影響［8-9］，所以本研究通過響應(yīng)面法對(duì)影響牡蠣肽與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的因素進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的美拉德反應(yīng)條件，其次通過電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)新鮮牡蠣（fresh oyster，F(xiàn)O）、牡蠣酶解產(chǎn)物（oyster enzymatic hydrolysates，OEH）、OEH與還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products of OEH and reducing sugar，MRPs-OEH）的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為新型牡蠣調(diào)味品的研究及開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

太平洋牡蠣（軟體組織平均質(zhì)量（15±5） g）青島齊東路水產(chǎn)市場(chǎng)；Alcalase酶美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠；GL-G-Ⅱ立式冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DU-20G電熱恒溫油浴鍋金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；GC6890-

5973MSD GC-MS儀美國(guó)安捷倫公司；固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）萃取頭30～50 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯美國(guó)Supelco公司；PEN3型便攜式電子鼻德國(guó)Asrinese公司。

1.3方法

1.3.1感官評(píng)定

表1　牡蠣美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Taabbllee 11 　CCrriitteerriiaa ffoorr ffl l aavvoorr eevvaalluuaattiioonn ooff MMaaiillllaarrdd rreeaaccttiioonn pprroodduuccttss

8 位感官評(píng)定員（4 男4 女），23～25 歲之間，系統(tǒng)學(xué)習(xí)過感官評(píng)定課程，有豐富的感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)，綜合牡蠣肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的滋味、氣味和外觀，按表1標(biāo)準(zhǔn)給出評(píng)分。感官評(píng)價(jià)時(shí)溫度為室溫（25 ℃），樣品隨機(jī)編號(hào)，感官評(píng)價(jià)最后得分為平均值。

1.3.2OEH的制備［10］

牡蠣軟體組織洗凈后打漿，料液比為1∶3（g/mL），調(diào)節(jié)pH值至8.0，按蛋白含量的0.3%添加Alcalase蛋白酶，55 ℃酶解0.5 h后置于沸水中滅酶10 min。5 000 r/min離心10 min后取上清液，將上清液冷凍干燥，得到OEH粉末。

1.3.3單因素試驗(yàn)

1.3.3.1反應(yīng)時(shí)間的影響

將油浴鍋溫度控制在115 ℃，按照木糖-葡萄糖質(zhì)量比1∶1添加還原糖，OEH-還原糖質(zhì)量比1∶1，調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH 7.0，控制反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、120 min進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.3.2反應(yīng)溫度的影響

按照木糖-葡萄糖質(zhì)量比為1∶1添加還原糖，OEH-還原糖質(zhì)量比為1∶1，調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH 7.0，油浴鍋溫度為105、110、115、120 ℃和125 ℃，反應(yīng)30 min。

1.3.3.3pH值的影響

將油浴鍋溫度控制在115 ℃，按照木糖-葡萄糖質(zhì)量比1∶1添加還原糖，OEH-還原糖質(zhì)量比為1∶1，調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，控制反應(yīng)時(shí)間30 min進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.3.4OEH-還原糖質(zhì)量比的影響

將油浴鍋溫度控制在115 ℃，按照木糖-葡萄糖質(zhì)量比1∶1添加還原糖，使OEH-還原糖質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH 7.0，控制反應(yīng)時(shí)間30 min進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.3.5還原糖配比的影響

將油浴鍋溫度控制在115 ℃，使木糖-葡萄糖質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，OEH-還原糖質(zhì)量比為1∶1，調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH 7.0，控制反應(yīng)時(shí)間30 min進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)［11］

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以感官風(fēng)味評(píng)價(jià)分值為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件統(tǒng)計(jì)，確定最優(yōu)美拉德反應(yīng)的工藝參數(shù)。因素水平如表2所示。

表2　因素與水平表Taabbllee 22 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn rreessppoonnssee ssuurrffaaccee eexxppeerriimmeennttss

1.3.5電子鼻的分析測(cè)定［12-13］

取OEH和OMRPs-OEH 2 mL（絞碎后的FO 2 g）置于50 mL進(jìn)樣瓶中，20～25 ℃密封一段時(shí)間進(jìn)行頂空氣體生成，采用頂空抽樣的方法進(jìn)行取樣并檢測(cè)。電子鼻在取樣的同時(shí)獲取并記錄數(shù)據(jù)，每秒記錄1 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，采樣時(shí)間為60 s，采樣后，WinMaster軟件自動(dòng)控制對(duì)傳感器陣列進(jìn)行清洗，清洗時(shí)間為90 s，電子鼻所獲得的數(shù)據(jù)有2 種形式，其一為樣品氣體通過傳感器陣列時(shí)各傳感器的電阻值R；其二為樣品氣體通過傳感器陣列時(shí)，傳感器的電導(dǎo)率G0與基準(zhǔn)氣體通過時(shí)傳感器的電導(dǎo)率G0的比值，即響應(yīng)值G/G0。

1.3.6揮發(fā)性氣體成分的測(cè)定［14］

頂空SPME條件：將4 mL OEH和2 mL OMRPs-OEH（或2 g FO）裝在20 mL SPME專用瓶中，60 ℃萃取30 min。萃取結(jié)束后立即將萃取針插入進(jìn)樣口（250 ℃）中解吸4 min。萃取頭在首次使用時(shí)需250 ℃老化1 h。

GC條件：HP-5毛細(xì)管色譜柱（5%苯基，95%聚二甲基硅氧烷）規(guī)格：30 m×0.32 mm，0.25 μm；載氣為高純氦氣（99.999%），氦氣流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫：初溫40 ℃恒溫3 min，以6 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

MS條件：電離源為電噴霧電離，離子阱溫度150 ℃，GC-MS傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍33～300 u，掃描速率0.220 s/scan。電噴霧電離電子能量70 eV。

利用Agilent G1701 MSD Productivity ChemStation增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析工作站NIST05a Libraries標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，選擇匹配度大于80（滿分100）作為鑒定結(jié)果。用峰面積歸一化法確定物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.3.7主成分分析（principal component analysis，PCA）法［15-16］

某一種物質(zhì)是否對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生很大影響不僅要看其含量還要分析其閾值，即揮發(fā)性化合物對(duì)于樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)由其在風(fēng)味體系中濃度和闊值共同決定的，因此，本研究通過采用氣味活度值（odor activity value，OAV）評(píng)價(jià)各化合物對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，計(jì)算如式（1）所示：式中：C為物質(zhì)含量/（mg/kg）；T為感覺閾值/（mg/kg）。若OAV＜l，說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味無實(shí)際作用；OAV＞1，說明該物質(zhì)可能對(duì)總體風(fēng)味有直接影響；且在一定范圍內(nèi)，OAV越大說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。

由于所研究樣品往往包含幾十甚至上百種揮發(fā)性化合物，絕對(duì)定量幾乎不可能。因此，食品風(fēng)味研究領(lǐng)域一般用化合物的相對(duì)含量Cr代替絕對(duì)含量進(jìn)行分析，即Cr≈C，各化合物的相對(duì)含量可以通過峰面積歸一化法計(jì)算得到。

為了便于分析本實(shí)驗(yàn)通過計(jì)算化合物的相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）的方法來評(píng)價(jià)該物質(zhì)對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。計(jì)算如式（2）、（3）所示：

即：

式中：Cri、Ti分別是各化合物的相對(duì)含量/（mg/kg）和感覺閾值/（mg/kg）；Cmax、Tmax是對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對(duì)含量/（mg/kg）和相應(yīng)的感覺閾值/（mg/kg）。

顯然，所有組分均滿足0＜ROAV≤100，且ROAV越大的組分對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)也越大，其中ROAV≥l的物質(zhì)為所分析樣品的主體風(fēng)味成分，而0.1≤ROAV＜l的物質(zhì)對(duì)樣品總體風(fēng)味也具有比較重要的貢獻(xiàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1美拉德反應(yīng)工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1反應(yīng)時(shí)間的確定

圖1　 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs-OEH風(fēng)味的影響Fig.1　Effect of reaction time on MRPs-OEH fl avor

由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間短于30 min時(shí)，由于反應(yīng)不充分，產(chǎn)生的風(fēng)味不夠濃郁。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過30 min，甚至更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，產(chǎn)品產(chǎn)生明顯的焦糊味和其他雜味。反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，感官評(píng)分達(dá)20.18，產(chǎn)品的風(fēng)味最好，因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min。反應(yīng)時(shí)間是影響美拉德反應(yīng)的重要因素之一，較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物含量較少，而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中產(chǎn)物的含量會(huì)增加，同時(shí)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的種類也會(huì)隨之增加，但是當(dāng)體系的反應(yīng)溫度過高時(shí)，反應(yīng)會(huì)急速加快，使得體系中形成大量的終產(chǎn)物類黑精，甚至是致癌物質(zhì)，因此要合理的控制反應(yīng)溫度［17-18］。

2.1.2反應(yīng)溫度的確定

反應(yīng)溫度是美拉德反應(yīng)一個(gè)非常重要的因素［19-20］。從圖2可看出，當(dāng)反應(yīng)溫度為115 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)19.13，MRPs-OEH的風(fēng)味最好。溫度過低時(shí)，MRPs-OEH的腥苦味去除的不明顯，這是由于反應(yīng)程度不夠，產(chǎn)生的香氣不夠濃郁，使得產(chǎn)品原有的腥味突顯出來；隨著溫度的升高，反應(yīng)速率加快，同時(shí)也會(huì)促成許多香味物質(zhì)的生成。但溫度過高時(shí)，MRPs-OEH帶有明顯的焦苦味，這是由于產(chǎn)物中雜味物質(zhì)增多，帶來了一些不利的風(fēng)味。因此確定最佳反應(yīng)溫度為115 ℃。

反應(yīng)溫度對(duì)MRPs-OEH風(fēng)味的影響Fig.2　Effect of reaction temperature on MRPs-OEH fl avor

2.1.3pH值的確定

圖3　pH值對(duì)MRPs-OEH風(fēng)味的影響Fig.3　Effect of pH on MRPs-OEH fl avor

pH值是影響美拉德反應(yīng)的重要因素之一，它不僅影響到原料的離解狀態(tài)和生成物種類，還會(huì)直接影響美拉德反應(yīng)進(jìn)程［21-22］。從圖3可看出，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，感官評(píng)分達(dá)19.14，MRPs-OEH的風(fēng)味最好。pH值過低會(huì)帶來一定的酸味，這是因?yàn)樵诘蚿H值條件下氨基呈質(zhì)子化，不能很好地與還原糖的羰基反應(yīng)，阻礙了美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，從而得不到大量的芳香類物質(zhì)；反之，pH值過高反應(yīng)速率過快，產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生明顯的焦糊味?？傊琾H值太高和太低，反應(yīng)都向不利于風(fēng)味物質(zhì)形成的方向進(jìn)行。因此確定最佳反應(yīng)pH值為7.0。

圖4　OEH-還原糖質(zhì)量比對(duì)MRPs-OEH風(fēng)味的影響Fig.4　Effect of ratio of enzymatic hydrolysates to reducing sugar on MRPs-OEH fl avor

2.1.4OEH-還原糖質(zhì)量比的確定OEH-還原糖質(zhì)量比對(duì)MRPs-OEH的風(fēng)味也有一定的影響［23］，由圖4可知，當(dāng)其配比為1∶1時(shí)，感官評(píng)分達(dá)19.44，MRPs-OEH的風(fēng)味最好，因此確定最佳的配比為1∶1。

2.1.5還原糖配比的確定

圖5　 還原糖配比對(duì)MRPs-OEH風(fēng)味的影響Fig.5　Effect of xylose/glucose ratio on MRPs-OEH fl avor

熱反應(yīng)中還原糖是重要的反應(yīng)物質(zhì)，還原糖的種類不同美拉德反應(yīng)液會(huì)呈現(xiàn)不同的風(fēng)味，并且美拉德反應(yīng)的速率也會(huì)不一樣，一般情況下在能夠發(fā)生美拉德反應(yīng)的幾種糖中反應(yīng)速率最快的是戊糖，其次是己糖，二糖的速率最慢。核糖、木糖、葡萄糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)均可以產(chǎn)生較好的風(fēng)味［24-25］。由于核糖的價(jià)格較貴，而木糖和葡萄糖價(jià)廉易得，因此試驗(yàn)選擇葡萄糖和木糖作為還原性糖。由圖5可知，木糖-葡萄糖質(zhì)量比在3∶1、2∶1和1∶1時(shí)，產(chǎn)品風(fēng)味都比較好且相差不大，結(jié)合這3 個(gè)條件下產(chǎn)品的褐變程度最終決定最佳的還原糖配比為木糖-葡萄糖質(zhì)量比2∶1，此時(shí)感官評(píng)分為19.80。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化美拉德反應(yīng)工藝參數(shù)

用SPSS軟件對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間這3 個(gè)因素存在顯著性差異，利用軟件Design-Expert，分別對(duì)其進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)15 個(gè)試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)組合及試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

表 4　方差分析表Table 4 Analysis of variance of response surface experiments

由方差分析（表4）可以看出，試驗(yàn)選用的模型極顯著（P=0.000 3＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.051 2＞0.05，不顯著；模型的校正系數(shù)RAdj=0.983 6，表明該模型可以解釋98.36%的感官評(píng)分的變化；R=0.994 2，表明試驗(yàn)誤差小，該模型適合分析美拉德反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響。

Design-Expert軟件進(jìn)行三元二次回歸擬合，獲得響應(yīng)面自然空間二次多項(xiàng)方程為：感官評(píng)分= －2 143.878 12－0.119 69A+192.585 42B+26.079 1C+ 0.052 500AB+0.015 000AC－0.020 000BC－0.033 396A2－13.758 33B2－0.115 08C2。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用軟件作響應(yīng)面圖，分析各因素的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。

圖 6　回歸模型各因素相互作用的效應(yīng)圖及等高線圖Fig.6　Response surface and contour plots showing the effect of reaction conditions on sensory evaluation of MRPs-OEH

如圖6a所示，反應(yīng)時(shí)間、pH值對(duì)感官評(píng)分都是非線性的，因?yàn)楸砻鎴D發(fā)生彎曲，所以可以進(jìn)一步優(yōu)化，從等高線圖看出，沿pH值方向等高線密度要大于沿反應(yīng)時(shí)間方向，說明pH值對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于反應(yīng)時(shí)間。如圖6b所示，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)感官評(píng)分都是非線性的，沿反應(yīng)溫度方向等高線密度要大于沿反應(yīng)時(shí)間方向，說明反應(yīng)溫度對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于反應(yīng)時(shí)間。如圖6c所示，pH值、反應(yīng)溫度對(duì)感官評(píng)分都是非線性的，沿反應(yīng)溫度方向等高線密度要大于沿pH值方向，說明反應(yīng)溫度對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于pH值。

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，通過對(duì)各因素顯著性和交互作用的分析，得出牡蠣肽美拉德反應(yīng)條件為：反應(yīng)時(shí)間29.43 min、反應(yīng)溫度114.62 ℃、反應(yīng)初始pH 6.97，此時(shí)牡蠣肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味最好，感官評(píng)定得分為20.25。

為檢驗(yàn)方法的可靠性，采用得到的最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行美拉德反應(yīng)，反應(yīng)條件為：反應(yīng)時(shí)間29.43 min、反應(yīng)溫度114.62 ℃、反應(yīng)初始pH 6.97、OEH-還原糖質(zhì)量比1∶1、還原糖配比（木糖-葡萄糖質(zhì)量比）2∶1，進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，得到該條件下的產(chǎn)品感官評(píng)分為20.88，和預(yù)測(cè)值20.25比，相對(duì)誤差約為3.08%，說明響應(yīng)面法能較好地對(duì)牡蠣美拉德反應(yīng)的條件進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.3電子鼻的分析

2.3.1PCA結(jié)果

圖 7　3 組樣品的PCAA圖Fig.7　Principal component analysis of sample 3

圖7為FO、OEH和OMRPs-OEH的PCA，可以看出橫軸的貢獻(xiàn)率為92.89%，縱軸貢獻(xiàn)率為7.08%，在橫軸方向各組存在顯著性差異，說明這3 種物質(zhì)的主要揮發(fā)性成分顯著不同，主要原因是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了一些芳香性風(fēng)味物質(zhì)。

2.3.2傳感器的G/G0響應(yīng)值分析

表5　3 組樣品的G/G0響應(yīng)值Taabbllee 55 　RReessppoonnssee vvaalluuee ooff eelleeccttrroonniicc nnoossee ttoo tthhee ffl l aavvoorr ooff ssaammppllee 33

表5為3 組樣品的G/G0響應(yīng)值，為了進(jìn)行更直觀的分析以響應(yīng)值作雷達(dá)圖，如圖8所示。通過分析各樣品揮發(fā)性成分的響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)，對(duì)于1號(hào)和3號(hào)傳感器的芳香成分，F(xiàn)O和OMRPs-OEH的差別不大，但均顯著高于OEH；對(duì)于5號(hào)傳感器的烷烴芳香成分，OMRPs-OEH的響應(yīng)值略高于FO，顯著高于OEH；對(duì)于9號(hào)傳感器，對(duì)有機(jī)硫化物靈敏的芳香成分，OMRPs-OEH的響應(yīng)值顯著高于FO和OEH。說明美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了一些芳香性的風(fēng)味物質(zhì)，有助于改善牡蠣酶解液的風(fēng)味。

圖 8 FO、OEH和OMRPs-OEH的響應(yīng)值雷達(dá)圖Fig.8　Response value radar chart of FL， OEH and OMRPs-OEH

2.4揮發(fā)性成分的SPME-GC-MS分析

2.4.1樣品揮發(fā)性氣體成分分析

表 6 FO、OEH和OMRPs-OEH揮發(fā)性成分分析TTaabbllee 66 　AAnnaallyyssiiss ooff vvoollaattiillee ccoommppoouunnddss ooff FFOO， OOEEHH aanndd OOMMRRPPss--OOEEHH

續(xù)表6

續(xù)表6

如表6所示，在FO中，檢測(cè)到30 種化合物，其中醛類10 種、酮類4 種、醇類6 種、烴類8 種、其他物質(zhì)2 種。在OEH中，檢測(cè)到36 種化合物，其中醛類8 種、酮類3 種、醇類4 種、酯類4 種、酸類3 種、吡嗪硫醚類2 種、烴類11 種、其他物質(zhì)1 種。在OMRPs-OEH中，檢測(cè)到45 種化合物，其中醛類9 種、酮類3 種、醇類4 種、酯類3 種、酸類3 種、硫醚類2 種、呋喃類4 種、吡嗪類4 種、吡唑類2 種、酚類2 種、烴類9 種。

2.4.2樣品主體揮發(fā)性成分分析

表 7 FO、OEH和OMRPs-OEH主體揮發(fā)性成分分析比較TTaabbllee 77 　AAnnaallyyssiiss aanndd ccoommppaarriissoonn ooff tthhee mmaaiinn vvoollaattiillee ccoommppoonneennttss ooff FO， OEH and OMRPs-OEEHH

本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為ROAV≥l的物質(zhì)為所分析樣品的主體風(fēng)味成分，但0.1≤ROAV＜l的物質(zhì)對(duì)樣品總體風(fēng)味也具有比較重要的貢獻(xiàn)。如表7所示，對(duì)于FO而言，ROAV＞1的揮發(fā)性成分包括1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-酮、（E）-2-癸烯醛、辛醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、2-戊烯醛、壬醛、2-十一酮和正己醛，它們綜合體現(xiàn)了新鮮牡蠣特征氣味中的類似植物的青草味、蘑菇味、花香、柑橘味；臘味、脂肪味等油脂味。對(duì)于OEH而言，ROAV＞1的揮發(fā)性成分包括癸醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、正辛醛、三甲胺、（Z）-2-癸烯醛、二甲基二硫醚，它們綜合體現(xiàn)了牡蠣酶解液的腥味、哈喇味、油脂味、蘑菇味、臘味等風(fēng)味。對(duì)于OMRPs-OEH而言，ROAV＞1的揮發(fā)性成分包括二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、葵醛，它們綜合體現(xiàn)了MRPs-OEH的貝香味、肉香味、油脂味、奶香味和海鮮味，同時(shí)產(chǎn)生了一些吡嗪類物質(zhì)，賦予了OMRPs-OEH一些堅(jiān)果-肉香味。

OEH經(jīng)過美拉德反應(yīng)以后，顯著改善了其腥味、哈喇味等不良風(fēng)味，同時(shí)產(chǎn)生了肉香味、奶香味等令人愉悅的氣味，這說明美拉德反應(yīng)是水產(chǎn)調(diào)味料去腥增香提鮮的一個(gè)重要途徑。

3　結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)牡蠣肽美拉德反應(yīng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定其優(yōu)化工藝條件為反應(yīng)時(shí)間29.43 min、反應(yīng)溫度114.62 ℃、反應(yīng)初始pH 6.97、OEH-還原糖質(zhì)量比1∶1、還原糖配比（木糖-葡萄糖質(zhì)量比）2∶1，并得到了牡蠣肽美拉德反應(yīng)各因素變量的二次方程，該模型回歸顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。因此，利用響應(yīng)面法對(duì)牡蠣肽美拉德反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)反應(yīng)條件。

進(jìn)一步通過電子鼻技術(shù)和SPME-GC-MS分析了新鮮牡蠣、OEH和最優(yōu)條件下的牡蠣美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)OEH經(jīng)過美拉德反應(yīng)以后，有效去除了其腥味、哈喇味等不良風(fēng)味，同時(shí)產(chǎn)生了肉香味、奶香味等令人愉悅的氣味。本研究為新型牡蠣調(diào)味品的研究及開發(fā)利用提供了參考。

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Optimization of Maillard Reaction for Oyster Enzymatic Hydrolysates and Reducing Sugar by Response Surface Methodology and Analysis of Volatile Flavor Compounds in Reaction Products

YUAN Lin， ZHA Fengchao， YAO Ye， HAN Kaining， LIU Min， DONG Shiyuan*
（High-Value Utilization of Seafood Laboratory， College of Food Science and Engineering，Ocean University of China， Qingdao266003， China）

Objective: To optimize the Maillard reaction conditions for oyster enzymatic hydrolysates and reducing sugar based on sensory evaluation of Maillard reaction products （MRPs）. Methods: The optimization was carried out using response surface methodology based on Box-Behnken experimental design. Electronic nose and gas chromatography-mass spectrometry were employed to analyze the volatile fl avor compounds of fresh oyster （FO）， oyster enzymatic hydrolysates （OEH）， optimal Maillard reaction products from oyster enzymatic hydrolysates and reducing sugar （OMRPs-OEH）. Results: The optimal reaction conditions were found as follows: extraction time， 29.43 min； temperature， 114.62 ℃； pH， 6.97； and ratio of enzymatic hydrolysates to reducing sugar （glucose:xylose = 1:2）， 1:1. Under these conditions， the experimental value of sensory evaluation score was 20.88， compared to the predicted value of 20.25. The relative error between the experimental and predicted values was 3.08%. A total of 30， 36 and 45 components were identifi ed from FO， OEH and OMRPs-OEH by GC-MS， respectively. The main volatile compounds of OEH were octanal， nonanal， decanal and （Z）-2-decenal， which were responsible for the unpleasant smells such as fi shy， rancid， and oily. After the Maillard reaction， dimethyl disulfi de， trimethyl disulfide and （Z）-4-heptenal became the main volatile compounds， which contributed to the shellfish， meat and seafood fl avors. Meanwhile， pyrazine substances were formed， which were responsible for some nuts-meat fl avors. Conclusions: The Maillard reaction not only can improve fi shy odor of OEH， but also can develop a new oyster fl avoring agent， which has highly economic and social value.

oyster； Maillard reaction； response surface methodology； electronic nose； gas chromatography-mass

2015-04-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270038）

袁林（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品高值化利用。E-mail：1171652412@qq.com

董士遠(yuǎn)（1974—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品高值化利用。E-mail：dongshiyuan@ouc.edu.cn

S986.2

A

1002-6630（2015）24-0001-09

10.7506/spkx1002-6630-201524001