劉欣 姜慶 戚威

(1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 山東濰坊 161061;2.臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 山東臨沂 276000;3.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 山東濰坊 161061)

近年來,隨著人們物質(zhì)文化生活水平的不斷進(jìn)步,人們對于食品、藥品的質(zhì)量和安全性問題也越來越重視。根據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示,食源性疾病和藥源性疾病患者的比例正在逐年上升,嚴(yán)重影響了人類的身體健康及生命安全[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的逐漸發(fā)展,其為食品和藥品微生物檢測工作提供了新的發(fā)展思路。筆者現(xiàn)就現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在食品、藥品微生物檢測中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行相應(yīng)的探討,旨在為微生物檢測及分型方法的發(fā)展提供依據(jù)。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是指在體外對特定的DNA片段進(jìn)行迅速擴(kuò)增的一種技術(shù),其機(jī)理為在機(jī)體外對目標(biāo)DNA和引物進(jìn)行變性、退火、延伸等3個(gè)步驟,以使目標(biāo)DNA進(jìn)行迅速的特異性擴(kuò)增。目前,人們通常采用PCR技術(shù)聯(lián)合核酸測序技術(shù)對微生物的基因型進(jìn)行確定。隨著PCR技術(shù)的逐漸發(fā)展,其目前已發(fā)展多種相關(guān)的技術(shù),且在微生物檢測中得到了廣泛的應(yīng)用,具體包括:(1)多重PCR技術(shù):該技術(shù)又稱為多重引物PCR技術(shù),與常規(guī)PCR技術(shù)相比,其在PCR技術(shù)的翻譯體系中加入了多對特異性的引物。該技術(shù)除了能夠同時(shí)對多種致病菌進(jìn)行檢測外,還可以準(zhǔn)確的分類致病菌的亞型,并且還能夠夠?qū)ξ⑸锏闹虏⌒赃M(jìn)行有效的判斷。(2)免疫捕獲PCR(IMPCR):該技術(shù)是通過將PCR技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合在一起,用于對微量抗原進(jìn)行檢測的新技術(shù)。IM-PCR既保留了PCR技術(shù)的高度靈敏性,又使用了抗原抗體反應(yīng)的特異性,具有操作簡單、檢測迅速、成本低及高度特異性等特點(diǎn),研究表明其檢測的靈敏度可以達(dá)到普通PCR技術(shù)的100倍,但是該方法尚未成熟,使用還受到了一定的限制[2]。(3)熒光定量PCR:由于受到模板、引物及酶等因素的限制,常規(guī)PCR技術(shù)無法根據(jù)其擴(kuò)增終產(chǎn)物對起始模板的拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)算,即不能定量分析初始模板。而熒光定量PCR(RT-PCR)是通過在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán),通過積累熒光信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR的整個(gè)過程,進(jìn)而對初始模板進(jìn)行定量分析。

2 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)的機(jī)理為按照DNA在不同濃度變性劑中接連程度的不同而體現(xiàn)出各不相同的電泳遷移率,從而對大小相同但堿基組成不同的片段進(jìn)行分離。該技術(shù)聯(lián)合DNA測序技術(shù)常用于進(jìn)行相似性聚類分析,在對食品和藥品的菌落組成、菌落動態(tài)變化及對食源性致病菌的檢查中得到了較為廣泛的應(yīng)用。相關(guān)學(xué)者通過對DGGE、PCR及核算測序技術(shù)系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建和優(yōu)化,有效分析了中藥川芎中真菌的群落結(jié)構(gòu),并通過聯(lián)合DNA測序技術(shù),對不同產(chǎn)區(qū)中中藥川芎中真菌的差異性進(jìn)行了想要的探究,從而得出了中藥川芎中真菌種群的種群結(jié)構(gòu)和多樣性具有的固定性等是影響中藥川芎地道性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[3]。DGGE在對微生物種群的多樣性及動態(tài)等方面具有一定的優(yōu)勢,但是其不能檢測微生物的數(shù)量和代謝活性。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的機(jī)理是通過和固定標(biāo)記的、已知序列的核酸探針雜交后在進(jìn)行核苷酸測序的方法,該技術(shù)目前在臨床診斷、新基因?qū)ふ?、藥物的篩選及微生物檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,其具有高度的多樣性、自動化、并行性及微型化,能夠在同一芯片上同時(shí)對多種維生素進(jìn)行迅速檢測。相關(guān)學(xué)者在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過程中分別采用宏觀基因組學(xué)、熒光定量PCR及基因芯片等3中技術(shù)對微生物的多樣性及功能進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示基因芯片具有搞高通量和集約化的優(yōu)點(diǎn),并且通常聯(lián)合宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以有效分析微生物的群落和功能[4]。

4 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)

隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)技術(shù)的機(jī)理為使用8～12個(gè)核苷酸長度的隨機(jī)引物于低溫環(huán)境下退火,經(jīng)過基因組DNA和引物之間的非特異位點(diǎn)錯(cuò)配進(jìn)行復(fù)性,同時(shí)利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。目前,RAPD技術(shù)在真菌、支原體和細(xì)菌等微生物的分型中得到了非常廣泛的應(yīng)用。相關(guān)學(xué)者通過利用PAPD技術(shù)對淡水中分離出來的溶血弧菌和溶藻弧菌進(jìn)行了有效的分型[5]。PAPD聯(lián)合其他技術(shù)能夠加快對重要基因的獲取速度,結(jié)合染色體步移技術(shù)可以對迅速完成對相關(guān)基因克隆分離及定位,而隨著該技術(shù)的成熟,其能夠在微生物的鑒定和分型上發(fā)揮更重要的作用。

5 結(jié)語

食品與藥品中存在的病原微生物直接關(guān)系到食品、藥品的質(zhì)量和安全,因此尋求新的、準(zhǔn)確的、靈敏度高的微生物快速檢測技術(shù)對于確保食品和藥品的質(zhì)量安全具有非常重要的意義?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展為食品、藥品微生物檢測工作提供了新的發(fā)展思路,明顯提高了微生物鑒定及分型的效率、準(zhǔn)確性及靈敏度,并且還能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行有效的定性和定量。但是傳統(tǒng)方法依然在微生物的檢測和鑒定中依然具有無法替代的作用[6]。由此可見,在食品、藥品微生物檢測工作中聯(lián)合傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能夠得到更為準(zhǔn)確和客觀的檢測結(jié)果,以有效支持相關(guān)部門對食品和藥品的質(zhì)量控制,確保人們的身體健康。

[1]劉銳萍,王峰,劉珊珊等.食品、藥品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2013,25(7):847-850.

[2]胡路.食品衛(wèi)生微生物檢測用培養(yǎng)基質(zhì)量控制探討[J].中國科技縱橫,2014,15(14):258-258,260.

[3]張靜華.藥物微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法研究[J].醫(yī)藥前沿,2014,42(14):148-149.

[4]歐陽麗影,楊錚,楊利紅等.黑龍江省保健食品微生物檢測結(jié)果分析[J].中國保健營養(yǎng)(下旬刊),2014,37(5):2968-2969.

[5]紀(jì)亮.“2012中國食品微生物檢測技術(shù)及實(shí)驗(yàn)室管理交流會”在蘇州舉辦[J].中國計(jì)量,2012,19(6):37-37.

[6]張?jiān)伱?微生物檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀[J].山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,13(6):封2-封3.