王樂(lè)，倪子富，惠明，王金水

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

引 言

琥珀酸作為許多重要化學(xué)品的直接或間接合成中間體被廣泛應(yīng)用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、新型綠色溶劑、高分子聚合物等化工產(chǎn)品，具有很高的商業(yè)價(jià)值[1-2]。目前生產(chǎn)琥珀酸的方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法兩種，化學(xué)合成法雖為目前琥珀酸生產(chǎn)的主要方法，但具有能耗高、污染大等缺點(diǎn)，不符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的要求[3]。近幾年隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展和逐漸成熟，生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸因兼具資源可再生利用及吸收CO2等優(yōu)勢(shì)具有廣闊的發(fā)展?jié)摿2]。

表1 產(chǎn)琥珀酸菌株的性能分析Table 1 Performance analysis of strains of succinic acid production

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究琥珀酸生產(chǎn)的熱門菌種有：產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母和重組大腸桿菌等[3]。表1對(duì)以上產(chǎn)琥珀酸菌種的性能進(jìn)行了分析，可知所有菌種在發(fā)酵生產(chǎn)中都存在一定的缺陷。但綜合各方面分析條件可以看出，大腸桿菌（E.coli）在琥珀酸生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)十分明顯，具有遺傳背景清楚[5,9]、代謝網(wǎng)絡(luò)明確[10]、易操作、易改造、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而大腸桿菌是目前用于研究琥珀酸代謝途徑和提高琥珀酸產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)基因工程菌種。

國(guó)外對(duì)利用基因工程菌E.coli發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的研究開(kāi)始于20世紀(jì)90年代，國(guó)內(nèi)在近幾年也逐漸成為研究的熱點(diǎn)[11]。野生大腸桿菌在厭氧條件下進(jìn)行混合酸發(fā)酵，副產(chǎn)物種類復(fù)雜且產(chǎn)量大，如果對(duì)E.coli調(diào)控代謝路徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行改造，如過(guò)量表達(dá)產(chǎn)琥珀酸代謝通路上的關(guān)鍵酶、敲除代謝競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶基因、導(dǎo)入外源酶基因等形式使碳流量主要流向琥珀酸[12]，則能大大改善生產(chǎn)琥珀酸的能力。另外，琥珀酸作為還原性的終端產(chǎn)物需要有充足的還原力才能推動(dòng)代謝底物向C4轉(zhuǎn)化，所以維持NAD(H)平衡和提高NAD(H)的水平對(duì)琥珀酸生產(chǎn)十分有利[13]。CO2作為輔助底物和酶激活劑調(diào)節(jié)著代謝流的分配比，保證CO2的充足供應(yīng)是一個(gè)重要的調(diào)控策略[14]。另外通過(guò)基因改造來(lái)增加其他代謝路徑也是提高琥珀酸產(chǎn)量的一種有效方法?？傊?，隨著各方面研究的深入，琥珀酸代謝控制發(fā)酵的方式也將更加趨于多樣和成熟。

本文將主要介紹代謝控制琥珀酸發(fā)酵的若干進(jìn)展。

1 對(duì)代謝路徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行調(diào)控

由于琥珀酸發(fā)酵的代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，涉及眾多酶催化反應(yīng)，對(duì)基因逐個(gè)改造難度大。所以通過(guò)對(duì)代謝路徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行改造，如增強(qiáng)主代謝路徑上的酶基因、引入表達(dá)外源相關(guān)酶基因、阻斷競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶基因表達(dá)等，可有效改變代謝通路中的碳流量分布，使琥珀酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度均有較大提高。

1.1 過(guò)量表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作為糖酵解的中間產(chǎn)物和琥珀酸的前體物是E.coli代謝的重要節(jié) 點(diǎn)[13]。PEP 羧化酶（PPC）和PEP 羧化激酶（PCK）是催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）到草酰乙酸（OAA）的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其活性大小直接影響流向琥珀酸的代謝流流量。Millard 等[1]在大腸桿菌中分別過(guò)量表達(dá)大腸桿菌的羧化酶基因ppc 和羧化激酶基因pck時(shí)發(fā)現(xiàn)，PPC 可能是催化PEP 生成OAA 的主要酶，并且具有直接催化PEP 生成琥珀酸的異生作用。但當(dāng)ppc 被敲除時(shí)，PCK 也能達(dá)到同樣的催化效果。也有人將藍(lán)藻細(xì)胞的ppc 基因?qū)肓姿徂D(zhuǎn)移酶PTS突變的大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)由于光合生物中ppc 基因?qū)O2的吸收活性高，所以顯著增強(qiáng)了PEP向OAA 的碳通路，同時(shí)磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）缺陷也有利于菌體對(duì)混合糖的吸收轉(zhuǎn)化[15]。曹劍磊等[16]利用Xer/dif 重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑中包括乙酸激酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ackA-pta）、乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）、乙醇脫氫酶基因（adhE）在內(nèi)的缺失突變大腸桿菌菌株，阻斷了副產(chǎn)物的生成路徑，同時(shí)又敲除葡萄糖吸收途徑中PTS 系統(tǒng)的pstG 基因，改變了大腸桿菌對(duì)葡萄糖的吸收方式，在此基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)ppc 基因，經(jīng)證實(shí)該菌株在厭氧條件下能高效轉(zhuǎn)化葡萄糖，琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度可以達(dá)到1.01 g·L-1·h-1，并且不存在乙酸、甲酸等副產(chǎn)物的生成，是極具工業(yè)化生產(chǎn)潛力的優(yōu)勢(shì)菌株。

Lee 等[17]在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)E.coli中的pck 時(shí)發(fā)現(xiàn)PPC 和PCK 的相對(duì)活力與 HCO3-的濃度有關(guān)，當(dāng) HCO3-濃度低時(shí)，羧化反應(yīng)主要由PPC 催化進(jìn)行；反之，由PCK 作為PEP 的主要催化酶。原因是PPC 對(duì)碳酸氫鹽的親和力和催化速率均高于PCK，但由于PCK 的催化反應(yīng)伴有能量生成，使菌株不必通過(guò)乙酸等其他途徑便可以合成ATP，因而在理論上更有利于促進(jìn)琥珀酸的積累及降低副產(chǎn)物的量，所以在高濃度的碳酸氫鹽下，PCK 占主導(dǎo)催化作用[18]。于麗等[5]以大腸桿菌W3110（Δpfl，Δldh）為出發(fā)菌株，利用λ-Red 同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了其 ppc 缺陷菌株并在此基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)了Bacillus subtilispck 基因，重組后大腸桿菌恢復(fù)厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，同時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到原來(lái)的15.3 倍。在兩階段發(fā)酵的有氧段加入乙酸鈉作為誘導(dǎo)劑可提高PCK 和PYK 的酶活進(jìn)而增加E.coliJM001 的產(chǎn)酸量，但也造成乙酸和丙酮酸過(guò)量積累，而通過(guò)敲除E.coliJM001 的ppc 基因同時(shí)導(dǎo)入外源B.subtilis168 的pck 基因，不但使有氧階段無(wú)須添加乙酸鈉便能達(dá)到更高的產(chǎn)酸收率，同時(shí)副產(chǎn)物較出發(fā)菌株大幅減少[19]。

在琥珀酸發(fā)酵的整個(gè)代謝通路中，并非只是依靠PPC 和PCK 便能完成所有反應(yīng)，發(fā)酵過(guò)程中諸如富馬酸還原酶（FrdABCD）、富馬酸酶等其他關(guān)鍵酶的參與對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的影響也至關(guān)重要[20]。通過(guò) 在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)FrdABCD 基因直接催化富馬酸合成琥珀酸的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，富馬酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到0.93 g·g-1[5]?？梢?jiàn)在發(fā)酵過(guò)程中增加富馬酸還原酶的表達(dá)量對(duì)減少富馬酸的積累、增加琥珀酸的產(chǎn)量也十分有利。另外有報(bào)道指出琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中富馬酸積累到一定濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生反饋抑制，造成蘋果酸的積累，因此在發(fā)酵結(jié)束后仍會(huì)有大量殘留的蘋果酸被排出或轉(zhuǎn)化為丙酮酸積累起來(lái)[21]。蘋果酸的積累使碳流量未能充分流向琥珀酸，造成資源的極大浪費(fèi)，所以富馬酸酶也是琥珀酸發(fā)酵中的關(guān)鍵酶。為解決這一問(wèn)題，Hong 等[20]在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)富馬酸酶，積累的蘋果酸得以消除，琥珀酸產(chǎn)量獲得進(jìn)一步增長(zhǎng)。

1.2 對(duì)競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶基因進(jìn)行精確敲除或失活

厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的代謝路徑復(fù)雜，常伴有乳酸、甲酸等副產(chǎn)物的生成，為獲得高濃度的琥珀酸積累，需要切斷其他無(wú)關(guān)代謝路徑，以保證更多的代謝流向琥珀酸分配。但某些基因在敲除或失活之后會(huì)影響相關(guān)蛋白質(zhì)的生成進(jìn)而造成菌體代謝強(qiáng)度降低，生長(zhǎng)緩慢等缺陷[22]。如表2所示，產(chǎn)琥珀酸菌株尤其是重組大腸桿菌在進(jìn)行不同類別的基因改造之后琥珀酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度改變程度各異，可見(jiàn)不同基因片段之間的表達(dá)差異相差巨大。Chong 等[29]通過(guò)將Ant Colony Optimization（ACO）和Minimization of Metabolic Adjustment（MoMA）相結(jié)合形成一種新型全面的混合算法，精確分析了大腸桿菌中琥珀酸代謝路徑上所需敲除的基因片段，在經(jīng)過(guò)精確敲除后琥珀酸產(chǎn)量得到提高，而生產(chǎn)強(qiáng)度較出發(fā)菌株變化不大。而Lee 等[30]將基因比較分析和計(jì)算機(jī)模擬代謝分析相結(jié)合的技術(shù)用于預(yù)測(cè)敲除基因，在比較了M.succinici producens和E.coli之后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)去除有關(guān)丙酮酸合成的基因（如pstG、pykF 和pykA 基因）來(lái)加強(qiáng)向琥珀酸的代謝流，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到原來(lái)的7 倍多，生產(chǎn)強(qiáng)度為原來(lái)的9 倍多。

表2 產(chǎn)琥珀酸菌種的厭氧發(fā)酵結(jié)果Table 2 Anaerobic fermentation result of succinic acid producing strains

2 調(diào)控NAD(H)對(duì)琥珀酸代謝的影響

大腸桿菌在厭氧及不接受外源電子受體下混合發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的量?jī)H占7.8%，其他大部分為乙醇、甲酸、乙酸和乳酸。這些副產(chǎn)物的生成降低了琥珀酸的產(chǎn)率，同時(shí)為后續(xù)的分離工作增加許多困難[31]。由圖1大腸桿菌的厭氧混合酸發(fā)酵代謝網(wǎng)絡(luò)可知，通過(guò)對(duì)大腸桿菌中乳酸脫氫酶的編碼基因（ldhA）和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因（pflB）的敲除或失活，可以有效阻斷甲酸、乳酸等副產(chǎn)物的生成使代謝流盡量向琥珀酸方向進(jìn)行分配，有利于提高琥珀酸的產(chǎn)量和純度[21]。但重組大腸桿菌在敲除ldhA和pflB 兩段基因后，糖酵解過(guò)程中的NADH 無(wú)法及時(shí)再生為NAD+，導(dǎo)致厭氧條件下輔酶NAD(H)嚴(yán)重不平衡，喪失代謝葡萄糖的能力。所以平衡NADH 和NAD+之間的比例是琥珀酸發(fā)酵的一個(gè)重要調(diào)控策略。同時(shí)琥珀酸作為還原性終端產(chǎn)物，需要有足夠的還原力才能推動(dòng)代謝流向琥珀酸的轉(zhuǎn)換，因此充足的NAD(H)也是必不可少的條件[20]。

圖1 大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Metabolic network of anaerobic fermentation for mixed acid by E.coli

2.1 NAD(H)的氧化還原態(tài)比例對(duì)琥珀酸發(fā)酵的 影響

實(shí)驗(yàn)研究證明過(guò)量表達(dá)NAD+依賴的關(guān)鍵酶可有效降低NADH/NAD+的比例，恢復(fù)重組大腸桿菌對(duì)葡萄糖的代謝，由于琥珀酸生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相偶聯(lián)，因而是琥珀酸積累的必要條件。此類酶主要有：蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶、煙酸單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶、煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶等[32-33]。梁麗亞等[9]通過(guò)少量IPTG 誘導(dǎo)重組大腸桿菌的蘋果酸脫氫酶使其酶活提高為原來(lái)的14.8 倍，NADH/NAD+的比例下降59.4%，使重組菌在厭氧條件下能夠正常代謝葡萄糖。茍冬梅等[32]過(guò)量表達(dá)了NAD(H)合成中的限速酶基因煙酸單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因，使NADH/NAD+的比例下降36%，NAD(H)總量提升2.63 倍，同時(shí)減少了丙酮酸的積累有利于琥珀酸的大量合成。Stols 等[33]將大腸桿菌中NAD+依賴的蘋果酸酶導(dǎo)入到E.coliNZN111 中并過(guò)量表達(dá)，在初始葡萄糖濃度為20 g·L-1下產(chǎn)生12.8 g·L-1琥珀酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到64%。劉嶸明等[34]則構(gòu)建了煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶的重組菌，在厭氧發(fā)酵中添加微量的煙酸和IPTG來(lái)誘導(dǎo)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶過(guò)量表達(dá)，使輔酶NAD(H)的總量提升3.85 倍，NAD+的濃度提高了5.17 倍，重組菌在厭氧條件下恢復(fù)生長(zhǎng)和代謝葡萄糖的能力。另外還有文獻(xiàn)指出，在有氧階段當(dāng)碳源由葡萄糖替換為乙酸鹽可對(duì)一些基因如aceBAk，mdh，pckA 等進(jìn)行正調(diào)控，而與PEP 有關(guān)的基因如pstG，PtsHIccr，pyk 受到負(fù)調(diào)控，最終有利于NAD+的再生，使得氧化還原反應(yīng)能持續(xù)進(jìn)行，琥珀酸的產(chǎn)量也有較大提高[35]。

在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)不同的氧化還原電位值（ORP）對(duì) NADH 的代謝通量分布及NADH/NAD+的比例也有較為顯著的影響[36]。但不同的菌株相適應(yīng)的氧化還原電勢(shì)范圍不盡相同[37]。以Actinobacillus succinogenesNJ113 為例，由于2 mol NADH 才能生成1 mol 琥珀酸，造成NADH 的短缺，所以例如甲酸、乙酸這些不需要NADH 的副產(chǎn)物得以形成來(lái)維持胞內(nèi)的氧化還原平衡。通過(guò)調(diào)節(jié)不同的ORP 水平，可以使代謝通路及某些關(guān)鍵酶的酶活發(fā)生變化，進(jìn)而影響NADH/NAD+的比例。當(dāng)ORP 在-350 mV 左右時(shí)可以使細(xì)胞中NADH 的總通量有明顯增加，同時(shí)對(duì)琥珀酸的積累產(chǎn)生有利影響[38]。

2.2 NAD(H)水平對(duì)代謝通路的影響

琥珀酸厭氧發(fā)酵過(guò)程中碳源經(jīng)糖酵解途徑被逐級(jí)氧化將NAD還原為NADH；而在琥珀酸生成途徑則將NADH 再生為NAD+，以維持氧化還原的平衡[39]。NAD(H)是生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的重要輔酶，在發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)NAD(H)濃度將對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生極大的影響[40]。王桂蘭等[10]通過(guò)利用不同的碳源做底物將過(guò)量表達(dá)蘋果酸酶的重組大腸桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)：還原性越強(qiáng)的碳源產(chǎn)生NADH 的量越多，發(fā)酵結(jié)束后琥珀酸產(chǎn)量也越高并且副產(chǎn)物乙酸等的產(chǎn)量越低。黃秀梅等[41]在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的厭氧發(fā)酵中外源添加0.5 g·L-1PEP，發(fā)現(xiàn)琥珀酸合成中的還原力得到補(bǔ)充，琥珀酸的產(chǎn)量也提高了11%，同時(shí)副產(chǎn)物的量也顯著降低。

NAD(H)的循環(huán)再生是維持生物正常生長(zhǎng)代謝的必要條件[42]，將甲酸脫氫酶應(yīng)用于輔酶NADH的再生中可以在一定條件下有效維持輔酶的催化水平[26]。目前利用甲酸/甲酸脫氫酶體系來(lái)構(gòu)建再生系統(tǒng)具有反應(yīng)不可逆、成本低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，其唯一副產(chǎn)物CO2不但可以維持一定的厭氧環(huán)境，而且有利于促進(jìn)琥珀酸的生成[43]。Heuser 等[44]通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因（pncB）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶基因（nadE）后，均使細(xì)胞中NAD(H)的總量增加了2 倍多，通過(guò)將這兩個(gè)基因共同表達(dá)后，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使胞內(nèi)的NAD(H)的總量增加了7倍多，琥珀酸的濃度也相應(yīng)提高數(shù)倍。

研究發(fā)現(xiàn)，敲除大腸桿菌部分關(guān)鍵酶基因后會(huì)影響其在厭氧條件下正常代謝葡萄糖的能力，其關(guān)鍵在于NAD(H)氧化還原失衡導(dǎo)致[32]。已有報(bào)道證實(shí)通過(guò)將內(nèi)源基因中的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因過(guò)量表達(dá)可以有效降低NADH/NAD+的比例[45]，與此同時(shí)，外源基因的引入和表達(dá)對(duì)改善NAD(H)平衡也取得了良好的效果。Stols 等[33]將豬蛔蟲Ascaris suum中的蘋果酸酶基因轉(zhuǎn)入到E.coliNZN111，以及 Lin 等[45]通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium中的煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因（pncB），也都達(dá)到了使NAD(H)的總量增加和NADH/NAD+比例降低的目的。菌體對(duì)葡萄糖的代謝得到恢復(fù)，由于琥珀酸積累和菌體生長(zhǎng)代謝相偶聯(lián)，使琥珀酸的濃度和累積速率均有明顯的提高。

3 CO2 調(diào)控策略對(duì)代謝控制的影響

3.1 CO2 的作用及固定CO2 的代謝途徑

生物法發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸中，CO2濃度是影響菌體生長(zhǎng)和代謝的重要因素[46]。本質(zhì)原因是CO2通常作為電子受體并通過(guò)濃度的變化來(lái)影響諸如PPC、PCK 和PYC 等涉及固定CO2的代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活，進(jìn)而影響C3向C4轉(zhuǎn)化的代謝流[47]。琥珀酸發(fā)酵中的關(guān)鍵分支節(jié)點(diǎn)是PEP，琥珀酸的產(chǎn)量受PEP 在兩條分支途徑中分配率的直接影響。催化PEP 生成草酰乙酸（OAA）的關(guān)鍵酶PPC 和PCK均具有固定CO2的作用，理論上每摩爾琥珀酸的生成需要消耗1 mol 的CO2，但通過(guò)過(guò)量表達(dá)這些關(guān)鍵酶可以有效提高CO2的固定效率，增加向琥珀酸的代謝通量[48]。Okino 等[49]在研究高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中加入碳酸氫鹽后菌體的產(chǎn)酸速率和濃度都有所增加，且不同的碳酸鹽濃度對(duì)菌體產(chǎn)酸的影響顯著，可見(jiàn)琥珀酸的產(chǎn)量與CO2的濃度有密切的關(guān)系。雖然有報(bào)道指出，外加CO2對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起消極作用，但對(duì)于琥珀酸的積累卻具有顯著提升，通過(guò)分析表明CO2對(duì)于PCK、PPC 和PYC 等都具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用，因此在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中，CO2的調(diào)控策略顯得十分必要[50]。

3.2 CO2 的外源供給形式

琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中CO2的外源供給形式主要有碳酸鹽和CO2[14]。圖2所示為CO2在發(fā)酵中的傳遞途徑。碳酸鹽通過(guò)與發(fā)酵液中所產(chǎn)生的有機(jī)酸反應(yīng)釋放CO2供菌體吸收，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH。使用CO2氣體時(shí)為保證發(fā)酵液中足夠的溶解度，常需要通過(guò)加適量堿液來(lái)保持發(fā)酵液呈弱酸性。陳可泉等[51]通過(guò)考察A.succinogenesNJ113的發(fā)酵過(guò)程發(fā)現(xiàn)，CO2氣體作為供體時(shí)菌體的生長(zhǎng)、固定化CO2效率、琥珀酸產(chǎn)率等均優(yōu)于碳酸鹽。而Wang 等[50]的研究結(jié)果則表明在E.coli中，利用 HCO3-如NaHCO3和MgCO3比單純通入CO2更有效，原因是 HCO3-對(duì)于PCK 的Km為13.0 mmol·L 而對(duì)于 PPC 為0.15 mmol·L-1，所以只有在高濃度的 HCO-3下才能促進(jìn)PCK 的酶活，并且達(dá)到調(diào)節(jié)pH 的效果，更有利于琥珀酸的生產(chǎn)。Zhu 等[52]采用正交實(shí)驗(yàn)、最速上升法、響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)氣體CO2作為唯一供體時(shí)其分壓對(duì)產(chǎn)酸并無(wú)較大影響，而當(dāng)CO2與MgCO3以一定比例混合加入時(shí)，產(chǎn)酸值最大。

圖2 CO2 在發(fā)酵中的傳遞途徑Fig.2 Transmission of carbon dioxide in fermentation

3.3 CO2 的濃度及固定對(duì)發(fā)酵的影響

琥珀酸在生物法發(fā)酵過(guò)程中通常采用的是兩階段發(fā)酵的策略。即先在有氧環(huán)境中使菌體大量增長(zhǎng)，然后通入CO2轉(zhuǎn)厭氧進(jìn)行發(fā)酵。其中在第二階段CO2的供給不足會(huì)導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)量下降，副產(chǎn)物增多，所以保證CO2在發(fā)酵液中有足夠的溶解度是保證琥珀酸產(chǎn)量的關(guān)鍵[51]。在生物固定CO2的過(guò)程中，影響CO2固定的因素有pH、CO2通氣量、溫度和攪拌速率等[53]。

pH 是影響CO2固定的重要因素。在琥珀酸發(fā)酵中，pH 主要通過(guò)影響CO2在發(fā)酵液中的溶解度及發(fā)酵液中碳酸的解離平衡，來(lái)影響菌體對(duì)CO2的利用度[54]。另外體系pH 的改變還會(huì)引起菌體內(nèi)外部化學(xué)環(huán)境和酶活力的變化[55]。目前所報(bào)道的琥珀酸發(fā)酵的pH 適宜范圍在6.2～7.2，在此條件下菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力較高[56]。通過(guò)采用不同堿性金屬離子作為琥珀酸放線桿菌A.ssuccinogenesNJ113 的pH 調(diào)節(jié)劑發(fā)現(xiàn)，Ca2+、NH4+對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝有較大阻礙作用，Na+的過(guò)量積累會(huì)增大發(fā)酵液中的滲透壓，對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制作用，此外在發(fā)酵后期還會(huì)產(chǎn)生菌體絮凝的現(xiàn)象；而以Mg2+作為調(diào)節(jié)劑可增加PCK 的酶活，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體代謝旺盛，琥珀酸產(chǎn)量有明顯提高，因此MgCO3是琥珀酸發(fā)酵時(shí)較好的堿性調(diào)節(jié)劑[54]。但由于MgCO3的成本高，耗量大，不符合工業(yè)發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性，所以有人通過(guò)采用混合堿NaOH 和Mg(OH)2或NaOH 和MgCO3等以適當(dāng)比例進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)取得了很好的效果，并有效降低了發(fā)酵成本，具備工業(yè)化發(fā)展的潛力[23]。通氣量水平直接影響發(fā)酵體系中CO2的溶解量，維持較高濃度的CO2通氣量對(duì)菌體產(chǎn)酸具有有利影響。實(shí)驗(yàn)表明在恒定的CO2供給下，琥珀酸產(chǎn)率保持穩(wěn)定同時(shí)菌體量也有所增加，可見(jiàn)CO2不僅參與產(chǎn)物合成，同時(shí)也是菌體生長(zhǎng)的必要物質(zhì)。溫度不僅影響CO2的溶解度也調(diào)控著菌體生長(zhǎng)代謝，不同菌體都有各自最適的溫度值，在最適溫度下CO2溶解度與菌體代謝相適宜，固定效率達(dá)到最高。攪拌轉(zhuǎn)速影響CO2與培養(yǎng)液的傳質(zhì)速率，轉(zhuǎn)速越大，CO2與培養(yǎng)液之間的傳質(zhì)速率越大，但當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到一定值時(shí)，CO2的固定速率達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的水平[51]。

4 代謝通路的改造策略

大腸桿菌厭氧發(fā)酵琥珀酸是典型的混合酸發(fā)酵，至少存在6 條琥珀酸的合成途徑[22]。在其代謝支路中，由PEP 經(jīng)PCK 和PPC 羧化反應(yīng)生成OAA，再到蘋果酸、富馬酸最后生成琥珀酸是大部分野生菌株發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的主要途徑。但通過(guò)對(duì)代謝通路中其他酶（如pncB）的調(diào)控、過(guò)量表達(dá)異源基因（如pyc）等控制策略，可以使其他代謝中間產(chǎn)物生成琥珀酸或其前體物，進(jìn)而增加代謝通量，達(dá)到提升琥珀酸產(chǎn)量的目的[12]。

4.1 構(gòu)建消耗丙酮酸的代謝通路去除反饋抑制

重組菌株在缺失pfl 和ldh 基因后，會(huì)造成丙酮酸的大量積累，反饋抑制了磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使菌體在厭氧條件下不能利用葡萄糖，阻斷了細(xì)胞的生長(zhǎng)[57]。Wang 等[58]利用敲除了葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶（ptsG）、乳酸脫氫酶（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶（pflA）基因的大腸桿菌，并用乳糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入大腸桿菌的異源丙酮酸羧化酶基因（pyc）進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)外源引入丙酮酸羧化酶基因，可產(chǎn)生能分解丙酮酸的丙酮酸羧化酶，不僅解除丙酮酸大量積累形成的抑制，同時(shí)增加了一條由丙酮酸（PYR）到琥珀酸前體草酰乙酸（OAA）的代謝通路，使琥珀酸的產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。利用乳糖代替IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，也降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。去除ldhA 和pflB 基因的工程菌通常造成輔酶的氧化還原不平衡而導(dǎo)致代謝終止，如果將煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因pncB 和外源丙酮酸羧化酶基因pyc 一同導(dǎo)入到大腸桿菌中，一方面過(guò)量表達(dá)的pncB 使NADH/NAD+的比例明顯降低，NAD(H)濃度增加，還原力得以加強(qiáng)；另一方面發(fā)酵過(guò)程中積累的丙酮酸通過(guò)丙酮酸羧化酶（PYC）的催化，生成了琥珀酸的前體物草酰乙酸，有效減少了副產(chǎn)物的比例，提高了琥珀酸的產(chǎn)量[59]。這種多基因調(diào)控對(duì)琥珀酸的生成具有協(xié)同調(diào)節(jié)的效果，有利于獲得高產(chǎn)量、低副產(chǎn)物的工程菌株。此外還有通過(guò)共同表達(dá)泛酸激酶和丙酮酸羧化酶使琥珀酸產(chǎn)量得到提高的報(bào)道[50]。對(duì)于減少丙酮酸的積累還存在有其他途徑，經(jīng)研究測(cè)定蘋果酸酶對(duì)蘋果酸的Km值為0.4 mmol·L-1，而對(duì)丙酮酸的Km值為16 mmol·L-1，雖然在正常條件下一般催化丙酮酸到蘋果酸的反應(yīng)，但由于逆向反應(yīng)在熱力學(xué)上有利，所以也可以通過(guò)過(guò)量表達(dá)蘋果酸酶，使得由于無(wú)法代謝而大量積累的丙酮酸通過(guò)逆向反應(yīng)生成蘋果酸，由蘋果酸最終轉(zhuǎn)化為琥珀酸，進(jìn)而增加流向琥珀酸的碳通量[60]。

4.2 構(gòu)建其他代謝通路促進(jìn)琥珀酸積累

有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)失活I(lǐng)clR 基因和ArcA 來(lái)使aceBAK 過(guò)量表達(dá)可形成一個(gè)新的琥珀酸代謝路 徑——乙醛酸代謝途徑（可以促進(jìn)乙酰CoA 向琥珀酸的代謝）。原來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)1 mol 琥珀酸需要消耗2 mol NADH，但以葡萄糖為底物產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程中1 mol 葡萄糖理論上能夠合成2 mol 琥珀酸，卻只能生成2 mol NADH，所以還原力嚴(yán)重不足[28]。而通過(guò)乙醛酸代謝途徑，1 mol OAA，2 mol 乙酰CoA和1 mol NADH 存在下可生成2 mol 琥珀酸，使NADH 與琥珀酸的比例降為1.25:1[61]。以上研究都是應(yīng)用兩階段發(fā)酵或絕對(duì)厭氧發(fā)酵的條件來(lái)生產(chǎn)琥珀酸，同時(shí)有研究指出，大腸桿菌也可以利用有氧環(huán)境來(lái)通過(guò)乙醛酸途徑代謝琥珀酸[30]?？嫡竦萚62]在將野生大腸桿菌分別敲除了琥珀酸脫氫酶（SDH），磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（Pta），丙酮酸氧化酶（PoxB），異檸檬酸裂解酶阻遏物（IclR）以及葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)Ⅱ（PtsG）基因后，成功構(gòu)建了可以好氧發(fā)酵琥珀酸的菌株，其主要原因是琥珀酸脫氫酶的SdhA 亞基可以阻斷琥珀酸的氧化，因而使琥珀酸在三羧酸循環(huán)中得以積累。

5 結(jié) 語(yǔ)

利用代謝控制發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸存在不可替代的優(yōu)勢(shì)，具有巨大的生產(chǎn)潛力。當(dāng)前對(duì)重組大腸桿菌及一些產(chǎn)琥珀酸菌株的代謝控制研究，主要集中于通過(guò)過(guò)量表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，維持輔酶NAD(H)的氧化還原的平衡以及增加其濃度，增加代謝途徑中的還原力，引入新的代謝途徑等方面。重點(diǎn)對(duì)重組大腸桿菌的代謝進(jìn)行調(diào)控操作，使琥珀酸成為生物代謝過(guò)程中的主產(chǎn)物，同時(shí)使其濃度和質(zhì)量收率也達(dá)到較高的水平。但由于琥珀酸的積累和菌體的生長(zhǎng)存在部分偶聯(lián)效應(yīng)，在對(duì)菌體進(jìn)行代謝控制策略后會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)，甚至需要進(jìn)行兩階段發(fā)酵等問(wèn)題，會(huì)在一定程度上限制琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Millard C S,Chao P,LiaoJ J,Donnelly M.Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase inEscherichia coli[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,1996,62 (5):1808-1810

[2]Jiang Min (姜岷),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Chen Kequan (陳可泉),Wang Yina (王益娜),Yu Li (于麗).The progress of recombinantEscherichia colifor production of succinic acid [J]Microbiology China(微生物學(xué)通報(bào)),2009,36 (1):120-124

[3]Song H,Lee S Y.Production of succinic acid by bacterial fermentation [J].Enzyme and Microbial Technology,2006,39:352-361

[4]Beauprez J J,Mey M D,Soetaert W K.Microbial succinic acid production:naturalversusmetabolic engineered producers [J].Process Biochemistry,2010,45 (7):1103-1114

[5]Yu Li (于麗),Jiang Min (姜岷),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Yue Fangfang (岳方方),Liu Shuwen (劉樹(shù)文).Effect of overexpression ofBacillus subtilisphosphoenolpyruvate carboxykinase on succinate production inEscherichia coli[J].Microbiology China(微生物學(xué)通報(bào)),2010,37 (3):325-330

[6]Song H,Huh Y S,Leea S Y,Hong W H,Hong Y K.Recovery of succinic acid produced by fermentation of a metabolically engineeredMannheimia succiniciproducensstrain [J].Journal of Biotechnology,2007,132 (4):445-452

[7]Yukihiko A,Tomoko K,Makoto S,Haruhiro M,Keiichiro E,Ritsuko K,Mitsuo O.Effect of gene disruptions of the TCA cycle on production of succinic acid inSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,87 (1):28-36

[8]Lemire B D,Oyedotun K S.TheSaccharomyces cerevisiaemitochondrial succinate:ubiquinone oxidoreductase [J].Biochimica et Biophysica Acta,2002,155 (3):102-116

[9]Liang Liya (梁麗亞),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Liu Rongming (劉嶸明),Wang Guangming (王光明),Xu Bing (徐冰),Zhang Min (張敏),Jiang Min (姜岷).Effect of overexpression of malate dehydrogenase on succinic acid production inEscherichia coliNZN111 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2011,27 (7):1005-1012

[10]Wang Guilan (王桂蘭),Wang Yina (王益娜),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Chen Kequan (陳可泉),Jiang Min (姜岷).Effects of different reduced carbon sources on succinic acid production by anaerobic fermentation of recombinantEscherichia coli[J].China Brewing(中國(guó)釀造),2009,204 (3):16-19

[11]Wu Minmin (武敏敏),Liu Hongjuan (劉宏娟),Zhang Jian’an (張建安),Xue Jianwei (薛建偉),Li Jinping (李晉平).Research advances in microbiol fermentation of succinic acid and its prospect [J].Modern Chemical Industry(現(xiàn)代化工),2008,28 (11):33-37

[12]Liu Rongming (劉嶸明),Liang Liya (梁麗亞),Wu Mingke (吳明科),Jiang Min (姜岷).Progress in microbial production of succinic acid [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2013,29 (10):1386-1397

[13]Hong S H,Lee S Y.Importance of redox balance on the production of succinic acid by metabolically engineeredEscherichia coli[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,58 (3):286-290

[14]Xi Yonglan (奚永蘭),Chen Kequan (陳可泉),Li Jian (李建),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Sui Shanshan (隋姍姍),Ye Guizi (葉貴子),Jiang Min (姜岷).Progress of CO2fixation in succinic acid fermentation process [J].Chemical Industry and Engineering Progress(化工進(jìn)展),2010,29 (7):1314-1319

[15]Wang D,Lia Q,Yang M,Zhang Y J,Su Z G,Xing J M.Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinantEscherichia coliwith ptsG mutation [J].Process Biochemistry,2011,46 (1):365-371

[16]Cao Jianlei (曹劍磊),Zhou Li (周麗),Zhang Liang (張梁),Wang Zhengxiang (王正祥),Shi Guiyang (石貴陽(yáng)).Construction and fermentation of succinate-producing recombinantEscherichia coli[J].China J.Appl.Environ.Biol.(應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)),2010,16 (6):851-857

[17]Kwon,Deok Y,Lee S Y.Influence of gluconeogenic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) expression on succinic acid fermentation inEscherichia coliunder high bicarbonate condition [J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,16 (9):1448-1452

[18]Tan Z G,Zhu X N,Chen J,Li Q Y,Zhang X L.Activating phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in combination for improvement of succinate production [J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79 (16):4838-4844

[19]Ma Jiangfeng (馬江鋒),Liang Liya (梁麗亞),Liu Rongming (劉嶸明),Zhang Min (張敏),Chen Kequan (陳可泉),Jiang Min (姜岷),Wei Ping (韋萍).Effects of fermentation regulation and molecular modification on succinate production byE.colibased key enzyme expression [J].Journal of Nanjing University of Technology:Natural Science Edition(南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版),2011,33 (3):58-61

[20]Hong S H,Lee S Y.Enhanced production of succinic acid by metabolically engineeredEscherichia coliwith amplified activities of malic enzyme and fumarase [J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2004,9 (4):252-255

[21]Zhang Yuxiu (張玉秀),Wang Jiao (王嬌),Wang Dan (王丹),Qi Feng (齊峰).The progress ofE.coliin genetic engineering for succinic acid production [J].China Biotechnology(中國(guó)生物工程雜志),2009,29 (7):108-117

[22]Wang L,Wu D P,Tang P W H,Fan X G,Yuan Q P.Xylitol production from corncob hydrolysate using polyurethane foam with immobilizedCandida tropicalis[J].Carbohydrate Polymers,2012,90 (2):1106-1113

[23]Zhao Jinfang (趙錦芳),Hua Bowen (華渤文),Wang Yongze (王永澤),Zhao Xiao (趙筱),Wang Jinhua (王金華).The construction of high yield succinic acid recombinantE.coliand anaerobic fermentation [J].The Food and Fermentation Industry(食品與發(fā)酵工業(yè)),2013,39 (1):6-10

[24]Tang Xuwei (唐緒位),Li Yunjie (李運(yùn)杰),Li Zhimin (李志敏),Ye Qin (葉勤).Xylose fermentation for succinic acid production byEscherichia coli[J].Biotechnology(生物技術(shù)),2014,24 (2):84-87

[25]Yu Li (于麗),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Yue Fangfang (岳方方),Liu Shuwen (劉樹(shù)文),Jiang Min (姜岷).Succinic acid production of recombinantE.colifermentation performance study [J].China Biotechnology(中國(guó)生物工程雜志),2010,30 (9):43-48

[26]Huang Zhihua (黃志華),Liu Ming (劉銘),Wang Baoguang (王寶光),Zhang Yanping (張延平),Cao Zhu’an (曹竹安).The progress of hydrogenlyase for NADH regeneration [J].The Chinese Journal of Process Engineering(過(guò)程工程學(xué)報(bào)),2006,6 (6):1011-1016

[27]Wang Chen (汪晨),Cai Heng (蔡恒),Zhang Hengli (張恒麗),Zhang Kai (張凱),Ouyang Pingkai (歐陽(yáng)平凱).Screening of strain exposed under plasma discharge for improving succinic acid production [J].Journal of Nanjing University of Technology:Natural Science Edition(南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版),2013,25 (1):57-60

[28]Liu Xuesheng (劉學(xué)勝),Jia Quandong (賈全棟),Zhang Weiguo (張偉國(guó)).Construction a metabolic engineering strain to produce succinic acid fromCorynebacterium glutamicumby gene deletion mutation [J].Microbiology China(微生物學(xué)通報(bào)),2013,40 (5):739-748

[29]Chong S K,Mohamadn M S,Mohamed Salleh A H ,Choon Y W,Chong C K,Deris S.A hybrid of ant colony optimization and minimization of metabolic adjustment to improve the production of succinic acid inEscherichia coli[J].Computers in Biology and Medicine,2014,49:74-82

[30]Lee S J,Lee D Y,Kim T Y,Kim B H,Lee J,Lee S Y.Metabolic engineering ofEscherichia colifor enhanced production of succinic acid,based on genome comparison and in silico gene knockout simulation [J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2005,72 (12):7880-7887

[31]Zheng Pu (鄭璞),Zhou Wei (周威),Ni Ye (倪曄),Jiang Min (姜岷),Wei Ping (韋萍),Sun Zhihao (孫志浩).Environmental factors affecting the succinic acid production byActinobacillus succinogenesCGMCC 1593 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2008,24 (6):1051-1055

[32]Gou Dongmei (茍冬梅),Liang Liya (梁麗亞),Liu Rongming (劉嶸明),Zhang Changqing (張常青),Wu Mingke (吳明科),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Chen Kequan (陳可泉),Zhu Jianguo (朱建國(guó)),Jiang Min (姜岷).Effect of overexpression of nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase on succinic acid production inEscherichia coliNZN111 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2012,28 (9):1059-1069

[33]Stols L,Kulkarni G,Harris B,Donnelly M.Expression of ascaris suum malic enzyme in a mutantEscherichia coliallows production of succinic acid from glucose [J].Applied Biochemistry and Biotechnology,1997,63-65:153-158

[34]Liu Rongming (劉嶸明),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Liang Liya (梁麗亞),Xu Bing (徐冰),Wang Guangming (王光明),Zhang Min (張敏),Jiang Min (姜岷).Effect of overexpression of nicotinic acid phosphoribosyl transferase on succinic acid production inEscherichia coliNZN111 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2011,27 (10):1438-1447

[35]Wu H,Li Z M,Zhou L,Ye Q.Improved succinic acid production in the anaerobic culture of anEscherichia colipflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceding aerobic culture [J].Chin.J.Biotech.,2007,73 (24):7837-7843

[36]Wang L,Yang M,Fan X G,Zhu X T,Xu T,Yuan Q P.An environmentally friendly and efficient method for xylitol bioconversion with high-temperature-steaming corncob hydrolysate by adaptedCandida tropicalis[J].Process Biochemistry,2011,46 (8):1619-1626

[37]Li J,Jiang M,Chen K Q,Ye Q,Shang L A,Wei P,Ying H J,Chang H N.Effect of redox potential regulation on succinic acid production byActinobacillus succinogenes[J].Biopro.Biosyst.Eng.,2010,33 (8):911-920

[38]Zhou Wei (周威),Zheng Pu (鄭璞),Ni Ye (倪曄),Jiang Min (姜岷),Wei Ping (韋萍),Sun Zhihao (孫志浩).Effects of culture redox potential on succinic acid production byActinobacillus succinogenesin anaerob is fermentation [J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering(生物加工過(guò)程) ,2008,6 (6):12-18

[39]Wang Yina (王益娜),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Chen Kequan (陳可泉),Zuo Peng (左鵬),Wu Xiaohua (吳曉花),Jiang Min (姜岷).Carbon source of recombinantE.colitwo-phase fermentation to produce succinic acid [J].China Biotechnology(中國(guó)生物工程雜志),2009,29 (3):57-62

[40]Wang L,Tang P W H,Fan X G,Yuan Q P.Effect of selected aldehydes found in the corncob hemicellulose hydrolysate on the growth and xylitol fermentation ofCandida tropicalis[J].Biotechnol.Prog.,2013,29 (5):1181-1189

[41]Huang Xiumei (黃秀梅),Jiang Min (姜岷),Li Jian (李建),Zheng Xiaoyu (鄭曉宇),Yang Zhuona (楊卓娜),Fang Xiaojiang (方曉江),Ye Guizi (葉貴子).Effect of adding intermediate metabolites on succinate production byActinobacillus succinogenes[J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2010,26 (9):1249-1256

[42]Wang L,Fan X G,Tang P W H,Yuan Q P.Xylitol fermentation using hemicellulose hydrolysate prepared by acid pre-impregnated steam explosion of corncob [J].J.Chem.Technol.Biotechnol.,2013,88 (11):2067-2074

[43]Wang Qingzhao (王慶昭).Metabolic engineering ofEscherichia colifor improved succinic acid production[D].Tianjian University (天津大學(xué)),2006:1-138

[44]Heuser F,Schroer K,Ltüz S.Enhancement of the NAD (P) (H) pool inEscherichia colifor biotransformation [J].Eng.Life Sci.,2007,7 (4):343-353

[45]Lin H,San K Y,Bennett G.Effect of sorghum vulgare phosphoenolpyruvate carboxylase and lactococcus lactis pyruvate carboxylase coexpression on succinate production in mutant strains ofEscherichia coli[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2005,67 (4):515-523

[46]Zou W,Zhu L W,Li H M,Tang Y J.Significance of CO2donor on the production of succinic acid byActinobacillus succinogenesATCC 55618 [J].Microbial Cell Factories,2011,87:1-10

[47]Chen Kequan (陳可泉),Jiang Min (姜岷),Wei Ping (韋萍),Su Li (蘇溧),Wu Hao (吳昊).Kinetic models for anaerobic fermentation of butanedioic acid [J].Journal of Chemical Industry and Engineering(China) (化工學(xué)報(bào)),2008,59 (11):2819-2823

[48]Lee P C,Lee S Y,Hong S H,Chang H N.Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium,Mannheimia succiniciproduces MBEL55E from bovine rumen [J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,58 (5):663-668

[49]Okino S,Noburyu R,Suda M,Jojima T,Inui M,Yukawa H.An efficient succinic acid production process in a metabolically engineeredCorynebacterium glutamicumstrain [J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,81 (3):459-464

[50]Wang W,Li Z M,Xie J L,Ye Q.Production of succinate by a pflB ldhA double mutant ofEscherichia colioverexpressing malate dehydrogenase [J].Bioprocess Biosyst.Eng.,2009,32 (6):737-745

[51]Chen Kequan (陳可泉),Jiang Min (姜岷),Su Li (蘇溧),Wei Ping (韋萍).CO2fixation byActinobacillus succinogenesin succinic acid production [J].Chemical Engineering(化學(xué)工程),2009,37 (1):49-52

[52]Zhu L W,Wang C C,Liu R S,Li H M,Wan D J,Tang Y J.Actinobacillu ssuccinogenesATCC 55618 fermentation medium optimization for the production of succinic acid by response surface methodology [J].BiomedResearchInternational,2012,doi:10.1155/2012/626137

[53]Liu Y P,Zheng P,Sun Z H,Ni Y,Dong J J,Zhu L L.Economical succinic acid production from cane molasses byActinobacillus succinogenes[J].Bioresource Technology,2008,99 (6):1736-1742

[54]Yang Zhuona (楊卓娜),Jiang Min (姜岷),Li Jian (李建),Fang Xiaojiang (方曉江),Ye Guizi (葉貴子),Bai Xuefei (白雪飛),Zheng Xiaoyu (鄭曉宇),Wei Ping (韋萍).Effects of different neutralizing agents on succinate production byActinobacillus succinogenesNJ113 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2010,26 (11):1500-1506

[55]Wang L ,Wu D P,Tang P W H,Yuan Q P.Effect of organic acids found in cottonseed hull hydrolysate on the xylitol fermentation byCandida tropicalis[J].Bioprocess Biosyst.Eng.,2013,36 (8):1053-1061

[56]Wang C C,Zhu L W,Li H M,TangY J.Performance analyses of a neutralizing agent combination strategy for the production of succinic acid byActinobacillus succinogenesATCC 55618 [J].Bioprocess Biosyst.Eng.,2012,35 (4):659-664

[57]Li Yikui (李宜奎),Kang Junhua (康俊華),Kang Zhen (康振),Geng Yanping (耿艷平),Wang Yiha (王義華),Qi Qingsheng (祁慶生).The preliminary study on mutant strains ofE.coliQQS101 in succinic acid fermentation [J].China Biotechnology(中國(guó)生物工程雜志),2010,30 (10):39-43

[58]Wang D,Li Q,Mao Y,Xing J M,Su Z G.High-level succinic acid production and yield by lactose-induced expression of phosphoenolpyruvate carboxylase in ptsG mutantEscherichia coli[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,87 (6):2025-2035

[59]Cao Weijia (曹偉佳),Gou Dongmei (茍冬梅),Liang Liya (梁麗亞),Liu Rongming (劉嶸明),Chen Kequan (陳可泉),Ma Jiangfeng (馬江鋒),Jiang Min (姜岷).Effect of co-expression of nicotinic acid phosphoribosyl transferase and pyruvate carboxylase on succinic acid production inEscherichia coliBA002 [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2013,29 (12):1855-1859

[60]Xie Xin (謝鑫),Chen Kequan (陳可泉),Liu Zhongmin (劉忠敏),Jiang Min (姜岷),Wei Ping (韋萍).Construction and anaerobic fermentation of metabolically engineeredEscherichia coliproducing succinate [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2008,24 (1):101-105

[61]Ailen M S,George N B,Ka Y S.Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway inEscherichia colito increase succinate [J].Yield and Productivity Metabolic Engineering,2005,7 (3):229-239

[62]Kang Zhen (康振),Geng Yanping (耿艷平),Zhang Yuanyuan (張園園),Qi Qingsheng (祁慶生).Construction of engineeredEscherichia colifor aerobic succinate production [J].Chin.J.Biotech.(生物工程學(xué)報(bào)),2008,24 (12):2081-2085