余璐璐 +曹中權(quán) 劉龍山 范　崎 黃格格 徐飛

摘要：鹽芥（Thellungiella salsuginea）是一種新型的模式植物，具耐鹽特性，但鹽芥的抗鹽機(jī)理仍不清楚。本研究對(duì)鹽芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)了鹽脅迫條件下CAS基因的表達(dá)變化。生物信息學(xué)分析表明，編碼鹽芥CAS合酶的基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，CAS合酶偏酸性，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中起作用。啟動(dòng)子分析表明，鹽芥CAS基因啟動(dòng)子上有多個(gè)鹽脅迫響應(yīng)元件。進(jìn)一步的鹽脅迫試驗(yàn)表明，鹽芥植株在200 mmol/L NaCl脅迫條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，CAS基因受脅迫誘導(dǎo)上升。鹽脅迫處理后9 h，CAS基因表達(dá)高出對(duì)照組材料2倍，氰化氫（HCN）含量被降低到較低水平。這些結(jié)果表明，CAS基因在鹽芥脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。

關(guān)鍵詞：鹽芥；氰丙氨酸合酶；鹽脅迫；基因分析；基因表達(dá)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0025-05

鹽芥（Thellungiella salsuginea）是一種有花的鹽生植物，與雙子葉植物研究中所常用的模式植物擬南芥親緣關(guān)系較近[1-2]。鹽芥具有對(duì)高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫極高的耐受能力，使得鹽芥成為研究植物非生物逆境脅迫機(jī)理的理想材料[3-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球擁有大面積鹽漬地，這些土地未能被完全開(kāi)發(fā)和利用[6]。我國(guó)鹽漬土面積約1億hm2，高鹽環(huán)境嚴(yán)重地影響了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，是造成作物減產(chǎn)的主要原因之一[6]。隨著世界范圍內(nèi)可耕地日趨減少以及鹽堿、干旱等極端氣候狀況的日趨嚴(yán)重，研究植物耐鹽脅迫的分子機(jī)制，尋找有效改良植物耐鹽性的方法，已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注，并已成為植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[7-8]。諸多研究表明，鹽脅迫等逆境因子會(huì)誘導(dǎo)乙烯反應(yīng)[9-10]，乙烯反應(yīng)的增強(qiáng)有助于植物減輕脅迫造成的傷害；所以，長(zhǎng)期以來(lái)乙烯也被賦予“脅迫乙烯”之稱。眾所周知，乙烯的生物合成經(jīng)蛋氨酸，在三磷酸腺苷（ATP）參與下，轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），SAM 在ACC合成酶（ACC synthase，ACS）的作用下轉(zhuǎn)化為1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carbox-ylic acid，ACC）和甲硫腺苷（5′-deoxy-5′ methylthioadenosine，MTA），ACC在ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）催化下產(chǎn)生乙烯[9]。值得注意的是，植物在產(chǎn)生乙烯的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生等量的氰化氫（hydrogen cyanide，HCN）[11]。HCN可抑制線粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素C氧化酶的活性，因而HCN對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)有很強(qiáng)毒性[11]。但是，植物具有產(chǎn)HCN并耐HCN的特性。一方面是因?yàn)橹参矬w內(nèi)存在一條由交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）介導(dǎo)的抗氰呼吸途徑（cyanide-resistance respiration pathway），可減輕HCN對(duì)呼吸鏈的抑制作用[12]。另一方面，HCN會(huì)誘導(dǎo)芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）的活性，從而將HCN降低到安全濃度范圍內(nèi)[13]。鑒于乙烯在鹽脅迫響應(yīng)中的重要作用，及CAS合酶與乙烯的密切關(guān)系，本研究以鹽芥植株為材料，對(duì)CAS基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)鹽脅迫條件下鹽芥CAS基因的表達(dá)量，以期為進(jìn)一步闡明鹽芥的耐鹽機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鹽芥CAS基因生物信息學(xué)分析

鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)利用在線分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）進(jìn)行分析。氨基酸序列分析及同源進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分別利用Vector NTI 11.5和MEGA 5.2軟件進(jìn)行。CAS基因亞細(xì)胞定位和蛋白成員理化性質(zhì)分別使用WolfPSORT （http：//psort.hgc.jp/）和ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。基因啟動(dòng)子響應(yīng)元件進(jìn)行在線分析（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）。

1.2 鹽脅迫條件下鹽芥CAS基因的表達(dá)分析

1.2.1 材料 鹽芥種子來(lái)源于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林宏輝教授實(shí)驗(yàn)室。鹽芥種子春化后播種在含營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（1 ∶1）的培養(yǎng)基質(zhì)上，同時(shí)施以1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng) 40 d 后幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 鹽脅迫處理 取6株長(zhǎng)勢(shì)一樣的鹽芥植株放置在平皿中，分為A、B 2組，然后用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液適應(yīng)培養(yǎng) 48 h。A組用200 mmol/L NaCl脅迫處理，B組為對(duì)照組。實(shí)時(shí)記錄2組幼苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 鹽芥總RNA的提取及基因表達(dá)分析 鹽芥總RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）試劑?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（TaKaRa公司試劑盒）后，熒光定量檢測(cè)CAS基因表達(dá)量（引物設(shè)計(jì)如表1所示）。熒光定量PCR擴(kuò)增使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒，每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的目的基因片段通過(guò)SYBR-green Ⅰ熒光來(lái)檢測(cè)，CT值用于檢測(cè)目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù)，目標(biāo)基因的相對(duì)含量通過(guò)相對(duì)CT值來(lái)表示，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。Actin基因作為內(nèi)參基因[14]。

1.2.4 氧化損傷檢測(cè)分析 鹽脅迫處理后，檢測(cè)H2O2、丙二醛、電導(dǎo)率及失水率的變化情況。H2O2含量的測(cè)定參照 Velikova 等的方法[15]。丙二醛（MDA）含量、電解質(zhì)滲漏和葉片失水率參照Xu等的方法[16]測(cè)定。

1.2.5 葉綠素含量檢測(cè) 葉綠素含量的測(cè)定參照Kichtenchaler等的方法[17]：稱取0.5 g葉片，用80%丙酮和少許 CaCO3 快速研磨成勻漿，然后用80%丙酮定容至20 mL；3 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定在470、646、663 nm處的吸光度（D）。

1.2.6 氰化氫含量檢測(cè) 氰化氫（HCN）含量檢測(cè)采用便攜式氣體檢測(cè)器（GT901-HCN）：植物材料在2 000 mL透明容器中密閉處理2 h后，用氣體檢測(cè)器檢測(cè)濃度。

2 結(jié)果和分析

2.1 鹽芥CAS基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)分析 利用在線分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）對(duì)鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明CAS基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子（圖1）。

2.1.2 鹽芥CAS蛋白同源比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 從NCBI找到20個(gè)已知CAS蛋白序列的物種，并與鹽芥CAS蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從圖2可以看出，鹽芥CAS蛋白序列與蕪菁、亞麻薺、擬南芥和煙草的CAS蛋白序列同源性較高，親緣關(guān)系較近，進(jìn)化處于同一分支。

2.1.3 鹽芥CAS蛋白的亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)分析 鹽芥CAS蛋白亞細(xì)胞定位使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3所示：鹽芥CAS蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)（預(yù)測(cè)比例達(dá)60.9%），其次是定位于線粒體和細(xì)胞核（預(yù)測(cè)比例均為13.0%），定位于過(guò)氧化物酶體和質(zhì)膜的可能性較低，預(yù)測(cè)比例分別為8.7%和4.3%。使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)鹽芥CAS蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表2所示，鹽芥CAS蛋白氨基酸長(zhǎng)度為323個(gè)，分子量為34 364.8 u。從理論等電點(diǎn)數(shù)據(jù)來(lái)看，CAS蛋白偏酸性（pI=5.47）。此外，蛋白不穩(wěn)定性分析顯示，鹽芥CAS蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為26.54，未超過(guò)臨界值（大于40被認(rèn)為不穩(wěn)定），表明CAS蛋白穩(wěn)定性較好。另外，從表2所顯示的平均親水性來(lái)看，CAS的親水性值為0.066，表明其是疏水性蛋白，不過(guò)數(shù)值并不太高，推測(cè)其應(yīng)是微溶于水。

2.1.4 鹽芥CAS基因的啟動(dòng)子分析 利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)找到CAS基因的基因編碼區(qū)上游序列，共計(jì)2 032 bp；利用日本PLACE在線分析系統(tǒng)對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，鹽芥CAS基因啟動(dòng)子具有大量的逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，包括W box、AGMOTIFNTMYB2、MYB1AT、TC rich元件等（圖4）。

2.2 鹽芥CAS基因在鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中的變化

2.2.1 鹽脅迫對(duì)鹽芥生長(zhǎng)的影響 在200 mmol/L NaCl脅迫處理12 h后，鹽芥植株葉片開(kāi)始卷曲，表現(xiàn)出明顯的失水現(xiàn)象和一定的氧化損傷；但是，鹽脅迫處理對(duì)鹽芥葉綠素的合成影響較小，鹽芥在脅迫處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)3 d，仍呈綠色狀態(tài)，失水情況未進(jìn)一步發(fā)生（圖5），表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性。

2.2.2 鹽脅迫對(duì)鹽芥CAS基因表達(dá)的影響 研究表明，鹽脅迫處理能明顯誘導(dǎo)CAS基因的表達(dá)（圖6）。與對(duì)照組相比，200 mmol/L NaCl鹽脅迫處理鹽芥幼苗后，CAS基因的表達(dá)明顯上升，尤其是在脅迫處理9 h后，CAS基因的表達(dá)量上升近2倍。由此推測(cè)，CAS基因參與了鹽芥鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論

與擬南芥相比，鹽芥耐貧瘠性強(qiáng)，生命力旺盛，根系強(qiáng)大；但到目前為止，鹽芥的抗逆機(jī)理仍不是很清楚。本試驗(yàn)對(duì)鹽芥CAS基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并研究了鹽芥CAS基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化，以期為進(jìn)一步揭示鹽芥對(duì)逆境脅迫的耐受機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過(guò)生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鹽芥CAS基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明，CAS基因啟動(dòng)子上有較多與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，包括 W-box、MYB響應(yīng)元件等。由此推測(cè)，CAS基因可能參與了鹽芥鹽脅迫應(yīng)答。CAS蛋白氨基酸長(zhǎng)度為323個(gè)，分子量為34 364.8 u，蛋白偏酸性（pI=5.47），微溶于水。從蛋白作用部位來(lái)看，CAS蛋白主要作用部位為細(xì)胞質(zhì)，其次為線粒體。鑒于CAS合酶是代謝植物HCN的關(guān)鍵酶，而HCN主要伴隨乙烯的合成產(chǎn)生，我們推測(cè)CAS合酶與降低鹽脅迫誘導(dǎo)乙烯合成過(guò)程中的HCN含量，及減輕HCN對(duì)線粒體呼吸

鏈的抑制作用有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，鹽芥在200 mmol/L NaCl脅迫條件下葉片表現(xiàn)出一定程度的損傷，H2O2、MDA和電解質(zhì)滲漏都有明顯上升，但整體生長(zhǎng)狀況良好，葉綠素含量仍維持在一個(gè)較高水平，表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性。據(jù)報(bào)道，鹽芥可以在500 mmol/L NaCl的高鹽生境下完成生活史，耐鹽能力遠(yuǎn)強(qiáng)于只能耐受100 mmol/L NaCl的擬南芥[18]。另有研究表明，鹽芥對(duì)高鹽的耐受性可能與鹽芥具有苗期生長(zhǎng)較旺、根系發(fā)達(dá)、葉肉致密等優(yōu)點(diǎn)有關(guān)[14，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理后，CAS基因的轉(zhuǎn)錄明顯上升。鹽脅迫處理9 h后，CAS基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，高出對(duì)照組近2倍。García等研究表明，CAS合酶表達(dá)的上升有助于減少逆境脅迫引起的活性氧（ROS）累積，從而減輕氧化損傷，維持植物的正常代謝生長(zhǎng)[20]。因此，本研究中CAS基因的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)該也是鹽芥對(duì)鹽脅迫高度適應(yīng)的原因之一。

從HCN含量變化檢測(cè)結(jié)果可以看出，在鹽脅迫3 h后，HCN含量開(kāi)始上升，在9 h后達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降，并在48 h后接近處理前的水平。這些結(jié)果表明，CAS合酶受HCN的誘導(dǎo)，鹽脅迫條件下CAS合酶表達(dá)量上升有助于減少細(xì)胞內(nèi)HCN的積累，減輕HCN對(duì)細(xì)胞尤其是線粒體的損傷。但同時(shí)也可看出，HCN在鹽脅迫處理3 d后，也沒(méi)有完全恢復(fù)到處理前的水平，表明低濃度的HCN在鹽芥鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程中具有一定作用。Xu等研究表明，低濃度的HCN（20 μmol/L）有助于提高黃瓜幼苗抵御鹽漬、干旱和冷害脅迫[12]。Seo等研究發(fā)現(xiàn)氰化物處理能提高水稻抵御真菌的侵害[21]。Liao等研究報(bào)道外施KCN能增強(qiáng)番茄對(duì)TMV的抗性[22]。此外，HCN被證實(shí)在種子萌發(fā)中起正調(diào)控的作用，還能作為氮源被植物吸收利用[23-24]。因此，進(jìn)一步研究CAS合酶與HCN間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，將有助于揭示植物的耐鹽機(jī)制。

總之，本研究表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性，CAS基因在鹽芥鹽脅迫適應(yīng)過(guò)程中受明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，CAS合酶通過(guò)有效降低HCN的濃度，保護(hù)線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。同時(shí)，低濃度的HCN可能在鹽芥逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中扮演著重要角色，但具體機(jī)制還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wu H J，Zhang Z H，Wang J Y，et al. Insights into salt tolerance from the genome of Thellungiella salsuginea[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（30）：12219-12224.

[2]王新宇，于 濤. 鹽芥耐鹽機(jī)制的組學(xué)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（20）：228-229，232.

[3]Higashi Y，Ohama N，Ishikawa T，et al. HsfA1d，a protein identified via fox hunting using Thellungiella salsuginea cDNAs improves heat tolerance by regulating heat-stress-responsive gene expression[J]. Molecular Plant，2013，6（2）：411-422.

[4]Pedras M，Zheng Q A. Metabolic responses of Thellungiella halophila/salsuginea to biotic and abiotic stresses：metabolite profiles and quantitative analyses[J]. Phytochemistry，2010，71（5/6）：581-589.

[5]Taranov V V，Berdnikova M V，Nosov A V，et al. Cold shock domain proteins in the extremophyte Thellungiella salsuginea （salt cress）：gene structure and differential response to cold[J]. Molecular Biology，2010，44（5）：889-897.

[6]楊勁松. 中國(guó)鹽漬土研究的發(fā)展歷程與展望[J].土壤學(xué)報(bào)，2008，45（5）：837-845.

[7]王寶山，趙可夫，鄒 琦.作物耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展及提高作物抗鹽性的對(duì)策[J].植物學(xué)通報(bào)，1997（增刊1）：26-31.

[8]李 彥，張英鵬，孫 明，等.鹽分脅迫對(duì)植物的影響及植物耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（1）：258-265.

[9]Abeles F B，Morgan P W，Saltveit Jr M E. Ethylene in plant biology[M]. New York：Academic Press，2012：56.

[10]Morgan P W，Drew M C. Ethylene and plant responses to stress[J]. Physiologia Plantarum，1997，100（3）：620-630.

[11]Lee T C，Kalenius E，Lazar A I，et al. Chemistry inside molecular containers in the gas phase[J]. Nature Chemistry，2013，5（5）：376-382.

[12]Xu F，Zhang D W，Zhu F，et al. A novel role for cyanide in the control of cucumber （Cucumis sativus L.） seedlings response to environmental stress[J]. Plant，Cell & Environment，2012，35（11）：1983-1997.

[13]Yi H，Juergens M，Jez J M. Structure of soybean β-cyanoalanine synthase and the molecular basis for cyanide detoxification in plants[J]. The Plant Cell，2012，24（6）：2696-2706.

[14]Gong Q Q，Li P H，Ma S S，et al. Salinity stress adaptation competence in the extremophile Thellungiella halophila in comparison with its relative Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2005，44（5）：826-839.

[15]Velikova V，Yordanov I，Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants：protective role of exogenous polyamines[J]. Plant Science，2000，151（1）：59-66.

[16]Xu F，Yuan S，Zhang D W，et al. The role of alternative oxidase in tomato fruit ripening and its regulatory interaction with ethylene[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（15）：5705-5716.

[17]Kichtenthaler H K，Wellburn A R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvent[J]. Biochemical Society Transactions，1983，603：591-593.

[18]Wang Z L，Li P H，F(xiàn)redricksen M，et al. Expressed sequence tags from Thellungiella halophila，a new model to study plant salt-tolerance[J]. Plant Science，2004，166（3）：609-616.

[19]Lugan R，Niogret M F，Leport L，et al. Metabolome and water homeostasis analysis of Thellungiella salsuginea suggests that dehydration tolerance is a key response to osmotic stress in this halophyte[J]. The Plant Journal，2010，64（2）：215-229.

[20]García I，Castellano J M，Vioque B，et al. Mitochondrial beta-cyanoalanine synthase is essential for root hair formation in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Cell，2010，22（10）：3268-3279.

[21]Seo S，Mitsuhara I，F(xiàn)eng J，et al. Cyanide，a coproduct of plant hormone ethylene biosynthesis，contributes to the resistance of rice to blast fungus[J]. Plant Physiology，2011，155（1）：502-514.

[22]Liao Y W，Shi K，F(xiàn)u L J，et al. The reduction of reactive oxygen species formation by mitochondrial alternative respiration in tomato basal defense against TMV infection[J]. Planta，2012，235（2）：225-238.

[23]Ebbs S D，Kosma D K，Nielson E H，et al. Nitrogen supply and cyanide concentration influence the enrichment of nitrogen from cyanide in wheat （Triticum aestivum L.） and sorghum （Sorghum bicolor L.）[J]. Plant，Cell & Environment，2010，33（7）：1152-1160.

[24]Gniazdowska A，Krasuska U，Bogatek R. Dormancy removal in apple embryos by nitric oxide or cyanide involves modifications in ethylene biosynthetic pathway[J]. Planta，2010，232（6）：1397-1407.