楊金宏

摘要：GspF是細菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的內(nèi)膜平臺的重要蛋白，利用PCR擴增技術(shù)，獲得了桑青枯雷爾氏菌MR111的含有該類基因功能性結(jié)構(gòu)域的GspF基因。NCBI在線BLASTP分析發(fā)現(xiàn)，該基因與雷爾氏菌屬來源的同源基因的一致性在90%以上；在聚類分析中，首先所有雷爾氏菌屬同源基因聚合在同一分支，后與皮氏羅爾斯頓菌的同源基因聚合。基因結(jié)構(gòu)分析表明，該基因有2個由α螺旋組成的具有高度相似性的、跨膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，揭示該基因可能參與細菌的跨膜分泌。

關(guān)鍵詞：桑青枯雷爾氏菌；Ⅱ型分泌系統(tǒng)；GspF基因；結(jié)構(gòu)分析

中圖分類號：S888.71+1 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0038-03

植物致病細菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）是由12～15個分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白（GSP）基因簇為中心組成的復(fù)合體，向細胞外分泌毒性因子、胞外酶、毒素等許多重要的蛋白質(zhì)，通過2步將蛋白從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞外[1]。GspF、GspL、GspM、GspE等共同組成T2SS的內(nèi)膜平臺，組裝其他分泌元件，控制分泌通道的開啟[2]。GspF是內(nèi)膜平臺中具有重要作用、并具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白，Thomas等通過分析GspF的氨基酸序列，結(jié)合歐文氏桿菌（Erwinia carotovora）的GspF與BlaM融合試驗證實GspF穿過內(nèi)膜3次，其N末端和C末端分別位于細胞質(zhì)和周質(zhì)[3]。2007年Arts等進一步通過堿性磷酸酶融合試驗證實了綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）中GspF的同源物的拓撲結(jié)構(gòu)，證實了GspF是一個質(zhì)膜蛋白[4]。2009年，Abendroth等對來自霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的EpsF（GspF的同源基因）的N末端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)進行了解析，其由6個反向平行α螺旋組成。2個分子EpsF蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域形成1個緊密的二聚體并具有保守的結(jié)合界面[5]。Peabody等對大量來自細菌的GspF基因序列的分析表明，所有基因類似，且其2個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列[6]。

植物青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的是一種具有嚴(yán)重危害的土傳性病害[7]，本研究以桑青枯雷爾氏菌為研究對象，獲得了桑青枯雷爾式菌的GspF基因的序列，并分析了其結(jié)構(gòu)特征，為進一步研究桑青枯雷爾氏菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的基因功能和泌出機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑青枯雷爾氏菌MR111由陜西省蠶桑重點實驗室分離培養(yǎng)并保存。細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）購自天根生化科技（北京）有限公司。dNTPs、EX Taq DNA聚合酶等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。培養(yǎng)桑青枯雷爾氏菌用的TTC固體培養(yǎng)基和SPA液體培養(yǎng)基等相關(guān)試劑均為分析純，自行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的活化與培養(yǎng) 超低溫冰箱取出保存的桑青枯雷爾氏菌，劃線于高壓滅菌的TTC培養(yǎng)基，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，活化菌株。挑取TTC培養(yǎng)基生長的單菌落于SPA培養(yǎng)基，繼續(xù)置于26 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 桑青枯雷爾氏菌基因組DNA的提取與GspF基因的PCR擴增 收集培養(yǎng)過夜的桑青枯雷爾氏菌MR111，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，并以此為模板，以設(shè)計的GspF基因的PCR擴增引物（F：5′-CGATATGCCAGCCTTCC-3′；R：5′-CGTGACCTGTTGT-TTGA-3′）進行PCR反應(yīng)，由于Gsp基因簇的GC含量相對較高（約70%），擴增體系中同時加入5%二甲基亞砜（DMSO），擴增桑青枯雷爾氏菌的GspF基因。使用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR擴增產(chǎn)物，并將PCR擴增產(chǎn)物送上海生工武漢測序部進行測序。

1.2.3 GspF基因序列的分析 NCBI在線BLAST比對桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列[8]，結(jié)合Rost等的方法[9]，分析基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域，并下載其他同源基因序列，進行序列的比對和結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列的獲取

以提取的桑青枯雷爾氏菌的基因組DNA為模板，GspF基因擴增引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果在1 000 bp上方獲得單一擴增條帶（圖1）。回收該條帶并進行測序，獲得GspF基因121 bp 至終止密碼子后49個堿基共1 138 bp的序列（GenBank登錄號：KM115545）。

NCBI在線分析基因編碼氨基酸，結(jié)果表明同其他基因一樣，GspF編碼的氨基酸有2個具有高度保守性的T2SF

（pfam00482）結(jié)構(gòu)、GspF（TIGR02120）結(jié)構(gòu)以及T2SS系統(tǒng)的組分GspF的典型結(jié)構(gòu)PulF（COG1459）（圖2）。

2.2 GspF基因的比對與聚類分析

NCBI在線BLASTP比對分析，GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌（Ralstonia pickettii）等雷爾氏菌屬（Ralstonia sp.）的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上，與伯克氏菌屬（Cupriavidus sp.）、伯克霍爾氏菌（Burkholderia sp.）等的相似性在均在80%以上。MEGA 5.0軟件[10]構(gòu)

建GspF基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。所有青枯雷爾氏菌的GspF基因聚合后與雷爾氏菌屬和羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合在一起，而伯克霍爾氏菌單獨位于樹的最遠分支，這與傳統(tǒng)分類一致。

2.3 GspF基因結(jié)構(gòu)的分析

V. cholerae的EpsF基因的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過晶體結(jié)構(gòu)進行解析，本研究結(jié)合BLAST比對和Rost等的方法[8-9]分析基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果2個基因的2個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相似性均在80%以上（圖4-A、B），GspF的前后2個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的相似性也在50%以上（圖4-C），基因的C端、N端都具有6個α螺旋，Met（171）、 Val（192）之間具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。這與Peabody等分析的2個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列一致[6]。

3 討論與結(jié)論

革蘭氏陰性菌中，細菌的跨膜分泌蛋白占細胞總蛋白的20%，與細菌毒素分泌到胞、表達細胞表面的膜蛋白等生命活動有關(guān)[11]。目前已經(jīng)在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)7種蛋白分泌機制，其中Ⅱ型分泌系統(tǒng)在革蘭氏陰性細菌中廣泛存在，該分泌系統(tǒng)以轉(zhuǎn)膜蛋白GSP基因簇為中心，突變會造成許多蛋白分泌的缺乏[12-13]。本研究獲得的桑青枯雷爾氏菌的GspF是具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白，BLAST軟件分析GspF（EspF）基因間具有高度的相似性，MR111的GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌以及雷爾氏菌屬的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上?；谠摶蜻M行聚類分析，所有雷爾氏菌屬聚合后再與羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合，伯克霍爾氏菌單獨位于樹的最遠分支，說明GspF基因的進化與細菌的進化是一致的，沒有經(jīng)歷基因的水平轉(zhuǎn)移[14]。

作為組成T2SS內(nèi)膜平臺的蛋白之一，GspF基因存在于所有的T2SS分泌系統(tǒng)中[1，15]，V. cholerae的基因EspF的二級結(jié)構(gòu)中存在6個反向平行螺旋，形成具有多個α螺旋構(gòu)成的跨膜區(qū)，把疏水基團放在骨架外側(cè)，而親水基團位于螺旋內(nèi)側(cè)，與有疏水性的脂雙層結(jié)構(gòu)的細胞膜融合，實現(xiàn)穿過細胞膜的分泌[5]。EspF與GspF形成α螺旋的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相似性在80%以上，GspF的2個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也具有50%以上相似性，均體現(xiàn)了作為分泌系統(tǒng)的重要組成基因在基因序列和結(jié)構(gòu)上的保守性。

本研究通過PCR技術(shù)獲得了桑青枯雷爾式菌MR111的GspF基因，并分析了基因間的相似性和結(jié)構(gòu)特征，為進一步研究該菌的分泌機制奠定了基礎(chǔ)?！?/p>

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