王 楊，于 淼，2，3

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研流動(dòng)站，哈爾濱150076)

中藥石蒜為石蒜科植物石蒜的鱗莖，是主要 存在于石蒜科植物鱗莖內(nèi)的生物堿.隨著研究的不斷深入，石蒜堿及其衍生物的藥理活性及作用機(jī)制的研究有了很大進(jìn)展[1].石蒜堿及其衍生物的藥理作用主要有[2－3]:催吐、祛痰、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱的作用[4];抗瘧疾、抗炎、抗病毒[5]、抗菌作用[6]、抗癌、抗腫瘤等作用[7－9].白血病是造血組織發(fā)生惡性病變，其特點(diǎn)是其他造血組織或骨髓中大量的白血病細(xì)胞無(wú)限增殖，并進(jìn)入外周血液，抑制正常血細(xì)胞的生成，侵犯人體臟器，最終通過(guò)這種浸潤(rùn)的方式，破壞全身組織、器官，造血功能受抑制[10].人白血病細(xì)胞K562是從白血病急變期患者的胸水中分離出來(lái)的，處于高度未分化狀態(tài)，是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞系中的一種[11].CLM是一種在早期多能干細(xì)胞上發(fā)生的惡性骨髓異常增殖性疾病，當(dāng)CLM進(jìn)入急變期往往對(duì)化療藥物不敏感[12－13].本文以人白血病 K562 細(xì)胞為靶細(xì)胞，探討石蒜堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.

P53基因是人體內(nèi)的抑癌基因，這個(gè)基因主要分布于細(xì)胞核漿中，能與DNA特異結(jié)合，該基因的突變會(huì)發(fā)生在50%以上的惡性腫瘤形成過(guò)程中.這個(gè)抑癌基因的失活是腫瘤形成的一個(gè)重要原因，由于P53基因可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，還有幫助修復(fù)細(xì)胞基因的缺陷的功能，進(jìn)而阻止了腫瘤的形成.P53基因編碼的蛋白質(zhì)作為一種轉(zhuǎn)錄因子控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)，該基因決定細(xì)胞分裂是否開(kāi)始.如果細(xì)胞受損，并且不能得到及時(shí)的修復(fù)，P53蛋白就會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)程序，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，使細(xì)胞“自殺”.而發(fā)生變化的細(xì)胞究竟是被修復(fù)還是被誘導(dǎo)凋亡是根據(jù)P53對(duì)DNA變異程度的判斷而決定的，如果DNA變異程度較小，P53基因就會(huì)促使細(xì)胞自我修復(fù);如果DNA變異程度較大，這個(gè)基因就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞株來(lái)源于哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院.

1.2 主要試劑及藥物

石蒜堿(純度98%)(上海阿拉丁試劑有限公司);羥基喜樹(shù)堿(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司);青霉素、鏈霉素(Gibco公司);CCK－8檢測(cè)試劑盒(日本同仁公司);P53抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);鼠抗Actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(碧云天生物科技研究所).

1.3 主要儀器

CO－170型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)New Brunswick Scientific公司);DL－CJ－1ND型超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);Model680酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO RAD公司);Olympus CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Adventurer萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)OHAUS公司);P型移液器(法國(guó)Gilson公司);垂直電泳儀(北京六一儀器廠);GIS－2019型凝膠成像系統(tǒng)(Tannon公司);Anke TDL80－2C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Allegra 64R冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECK－MAN－COULTER公司);TS－1000型震蕩儀(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

K562細(xì)胞接種于10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng).K562細(xì)胞按4×105/mL接種，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h，傳代1次，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.2 CCK－8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，按4×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL.實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔Ab(不含細(xì)胞和石蒜堿的培基);對(duì)照孔Ac(含細(xì)胞，不含石蒜堿的培基);實(shí)驗(yàn)孔As(含細(xì)胞的培基，給予不同濃度石蒜堿).12 h后加入配制好的石蒜堿溶液、羥基喜樹(shù)堿溶液.石蒜堿實(shí)驗(yàn)組終濃度分別為 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L，對(duì)照組加等量的RPMI－1640培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔.羥基喜樹(shù)堿實(shí)驗(yàn)組終濃度分別為 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L，對(duì)照組加等量的RPMI－1640培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔.置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL 的CCK －8 10 μL，繼續(xù)孵育2～4 h，置酶標(biāo)儀上用450 nm和570 nm雙波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值(OD值).活細(xì)胞數(shù)目與檢測(cè)的OD值大小呈正相關(guān).實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次.描繪生長(zhǎng)曲線，計(jì)算IC50值.

細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下:

(細(xì)胞抑制率為50%，即為半數(shù)抑制率，可用半數(shù)抑制濃度(IC50)表示.)

2.3 倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組(不含石蒜堿);實(shí)驗(yàn)組(給予不同濃度石蒜堿);陽(yáng)性藥組(給予羥基喜樹(shù)堿).將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，按4×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL.12 h后加入配制好的石蒜堿溶液、羥基喜樹(shù)堿溶液，實(shí)驗(yàn)組石蒜堿終濃度分別為2、4、8 μmol/L;羥基喜樹(shù)堿組終濃度為6 μmol/L;對(duì)照組加等量的RPMI－1640培養(yǎng)液.37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并采集圖像.

2.4 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，按4×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1mL.12 h后加入配制好的石蒜堿溶液、羥基喜樹(shù)堿溶液，實(shí)驗(yàn)組石蒜堿終濃度分別為2、4、8 μmol/L;羥基喜樹(shù)堿組終濃度為6 μmol/L;對(duì)照組加等量的RPMI－1640培養(yǎng)液.37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，將K562細(xì)胞收集到離心管中，1 200 rpm，5 min，棄上清.用冷PBS洗兩遍，離心棄上清.將此時(shí)的細(xì)胞重懸于70%冰乙醇溶液中，4℃固定過(guò)夜.將固定好的細(xì)胞1 200 r/min，5 min離心，棄上清.冷PBS洗1遍，離心，將上清液慢慢從離心管中吸出，留約50 μL液體，輕輕重懸，將細(xì)胞加入到配好的PI染液(含PI 50 mg/mL、RNase 1 g/L、0.1%Triton －100)中.室溫下避光染色30 min后，300目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為104個(gè).

2.5 Western－blot法檢測(cè)P53蛋白表達(dá)情況

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，按4×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中.12 h后加入配制好的石蒜堿溶液、羥基喜樹(shù)堿溶液，實(shí)驗(yàn)組石蒜堿終濃度分別為2、4、8 μmol/L;羥基喜樹(shù)堿組終濃度為6 μmol/L;對(duì)照組加等量的RPMI－1640培養(yǎng)液.37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，4℃、12 000 r/min離心15 min，提取按以上處理孵育48 h的K562細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量.100℃變性10 min，每個(gè)梳子孔中分別加入30 μg含5×蛋白，在12%SDS－PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，80 V直至條帶到底端，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃，一抗孵育過(guò)夜，洗膜后，二抗室溫振蕩器振蕩孵育2 h，DAB顯色液暗室顯色，觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行分析.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.所得數(shù)據(jù)均被表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn).P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞系增殖的抑制作用

不同濃度的石蒜堿作用于K562細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用.將六個(gè)不同濃度石蒜堿接種細(xì)胞48 h時(shí)，隨著石蒜堿濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低，將酶標(biāo)儀測(cè)出的吸光度值代入公式計(jì)算得出石蒜堿IC50=4.13 μmol/L.根據(jù)公式計(jì)算石蒜堿對(duì)人白血病K562細(xì)胞的抑制率，繪制抑制曲線，見(jiàn)圖1.

圖1 石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的抑制曲線

3.2 倒置顯微鏡觀察K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

以下為不同濃度石蒜堿作用K562細(xì)胞48 h后，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化圖(見(jiàn)圖2).未經(jīng)藥物處理的48 h空白對(duì)照組的K562細(xì)胞呈圓球形，形態(tài)飽滿，大小均一，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛;經(jīng)藥物作用后，細(xì)胞外形不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，大小不一，細(xì)胞破碎程度隨給藥劑量增加而增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸較少，有凋亡小體生成，呈濃度正相關(guān)關(guān)系.高劑量組有壞死傾向.

圖2 不同濃度石蒜堿作用K562細(xì)胞72 h后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察圖

3.3 PI單染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

由圖3顯示結(jié)果可知:石蒜堿作用于人K562細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的亞二倍體峰，該峰的出現(xiàn)抑制了DNA的合成.經(jīng)計(jì)算得出凋亡率分別為:(4.8 ± 0.60)%、(27.2 ± 1.31)%、(19.0 ± 1.93)%、(16.6 ±1.89)%、(13.8 ±1.52)%，有顯著性差異(P＜0.05).由此可見(jiàn)，隨著給藥劑量的減少，細(xì)胞凋亡率降低.(見(jiàn)表1)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石蒜堿作用K562細(xì)胞凋亡率

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率

3.4 Western－blot法檢測(cè)石蒜堿對(duì)P53蛋白表達(dá)水平變化

用終濃度分別是8、4、2 μmol/L的石蒜堿作用于白血病K562細(xì)胞48 h后，Western－blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，P53蛋白的灰度值隨給藥劑量的增加逐漸加深.表名石蒜堿能夠上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，P53蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、表2所示.

圖4 石蒜堿對(duì)P53蛋白表達(dá)的影響

表2 石蒜堿對(duì)白血病K562細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用石蒜堿作用于人白血病K562細(xì)胞后，CCK－8試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且作用相對(duì)明顯.抑制率具有劑量依賴(lài)性，隨著藥物劑量的加大，抑制率逐漸升高.光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果顯示相對(duì)于未給藥的K562細(xì)胞，給與不同劑量的石蒜堿，隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞體積大小不一，碎片化程度逐漸升高，高劑量組出現(xiàn)凋亡小體.碘化丙啶染色細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，DNA直方圖上G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)凋亡峰，根據(jù)這個(gè)凋亡峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞占整個(gè)樣品的百分率，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡百分率升高，說(shuō)明石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用與凋亡有關(guān).

Western－blot法檢測(cè)P53蛋白表達(dá)情況研究中，由于P53基因是人體內(nèi)的抑癌基因，這個(gè)抑癌基因的啟動(dòng)說(shuō)明細(xì)胞正處于自我修復(fù)或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡狀態(tài)，所以本實(shí)驗(yàn)中石蒜堿的作用引起P53基因表達(dá)升高，也可以說(shuō)明石蒜堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，P53蛋白起到了抑制癌細(xì)胞繼續(xù)生成的作用.綜上所述，石蒜堿可能是通過(guò)上調(diào)抑癌基因P53基因的表達(dá)，誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用.但其在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的途徑上，具體經(jīng)過(guò)哪一條凋亡誘導(dǎo)途徑，還有待進(jìn)一步研究，這也為石蒜堿在將來(lái)的臨床抗腫瘤新藥的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

[1]秦昆明，李 笑，徐 昭，等.石蒜堿及其衍生物的藥理作用研究概況[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，23(1):6－10.

[2]于 淼，于 洋，劉林濤.石蒜堿對(duì)人白血病細(xì)胞K562凋亡作用的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，30(2):157－160.

[3]宋德芳，石子琪，辛貴忠，等.石蒜科生物堿的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2013，22(13):1519－1524.

[4]CITO LU G S，ACIKARA O B，YILMAZ B S，et al.Evaluation of analgesic，anti－inflammatory and hepatoprotective effects of lycorine from Sternbergia fisheriana(Herbert)Rupr[J].Fitoterapia，2012，83(1):81－87.

[5]LIU J N，YANG Y J，XU Y F，et al.Lycorine reduces mortality of human enterovirus 71－infected mice by inhibiting virus replication[J].Virol J，2011(8):483 －452.

[6]CHEESMAN L，NAIR J J，VAN STADEN J.Antibacterial activity of crinane alkaloids from Boophonedisticha(Amaryllidaceae)[J].J Ethnopharmacol，2012，140(2):405－408.

[7]LIU R，CAO Z，TU J，et al.Lycorine hydrochloride inhibits metastatic melanoma cell－dominant vasculogenic mimicry[J].Pigment Cell Melanoma Res，2012，25(5):630 －638.

[8]VAN GOIETSENOVEN G，ANDOLFI A，LALLEMAND B，et al.Amaryllidaceae alkaloids belonging to different structural subgroups display activity against apoptosis－resistant cancer cells[J].J Nat Prod，2010，73(7):1223 －1227.

[9]張 珂，馬勝林.天然藥物抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào))，2011，10(26):2344－2347.

[10]WONG O，HARRIS F，YIYING W，et al.A hospital－based case control study of acute myeloid leukemia in Shanghai:analysis of personal characteristics，life style and environmental risk factors by subtypes of the WHO classification [J].RegulToxicol Pharmacol，2009，55(3):340－352.

[11]李 煜，孫 霄，馬 玲.雙嘧達(dá)莫對(duì)誘導(dǎo)K562人慢性髓原白血病細(xì)胞凋亡的研究[J].毒理學(xué)雜志，2013，27(3):200－203.

[12]黃玉，遲小華，楊波.依硫磷酸對(duì)人慢性髓細(xì)胞白血病K562 細(xì)胞系增殖的抑制作用[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32( 8) : 855 － 857.

[13]李盈，宋冬雪，汲晨峰，等.巖藻甾醇誘導(dǎo)人早幼粒白血病HL － 60 細(xì)胞凋亡[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版，2001，27( 6) : 788 － 793.