郭玉巖，孟令超，呂邵娃，王 銳，李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

鹽酸青藤堿為防己科防己屬植物青風(fēng)藤主要成分－青藤堿的鹽酸鹽，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕等作用，主要用于風(fēng)濕及類(lèi)風(fēng)濕性疾病的治療[1].但由于其具有釋放組胺作用而致皮疹、胃腸道不適等副作用，使其體內(nèi)給藥受到限制[2].本文以鹽酸青藤堿為主要成分，加適宜輔料，制備成經(jīng)皮給藥制劑(鹽酸青藤外敷散)[3－4]，將本產(chǎn)品直接作用于患處，增加炎性關(guān)節(jié)局部藥物質(zhì)量濃度、提高療效的同時(shí)，降低藥物的毒副作用[5].由于局部給藥制劑藥物吸收入血量較少、且很難客觀評(píng)價(jià)藥物在局部病灶組織的吸收情況，為此本文對(duì)鹽酸青藤外敷散局部貼敷給藥后在局部炎性組織的吸收情況進(jìn)行研究，總結(jié)鹽酸青藤外敷散在局部病變部位局部藥動(dòng)學(xué)行為，用以評(píng)價(jià)鹽酸青藤堿局部經(jīng)皮給藥制劑的性能.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

主要儀器有Waters 2690高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);組織勻漿機(jī) MINI－16(Bead Beater公司);D－37520超速低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)

鹽酸青藤外敷散(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制);青藤堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0774－201206);色譜純甲醇、乙腈(美國(guó)，Dikma);角叉菜膠(美國(guó)，Sigma);其他試劑為市售分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，合格證號(hào):P00102009，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，(生產(chǎn)許可證SCXK黑2008004).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相為磷酸緩沖鹽(0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液，加1‰三乙胺，磷酸調(diào)pH值3.0)－甲醇(80∶20);檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量 10 μL.

2.2 對(duì)照品溶液制備

取經(jīng)105℃干燥至恒重的青藤堿對(duì)照品約3.0 mg，精密稱(chēng)定 2.82 mg，置 100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得.

2.3 組織樣品的制備及處理

取健康的Wistar大鼠，左后足底皮下注射1%角叉菜膠(0.l mL/只)，30 min后，將青防腫痛外敷散貼于造模足跖處，固定.24 h后，將其給藥足剪下置于組織勻漿管中，依次加入氯化鈉溶液3 mL及甲醇溶液2 mL勻漿3次，離心.取上清液置25 mL量瓶中，甲醇溶液定容，離心5 min(轉(zhuǎn)速5 000 r/min)，取上清液5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，離心，取上清液濾過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定即可.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1)專(zhuān)屬性考察

按比例加入有關(guān)組織及相關(guān)輔料，按“2.1.3”制成相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的空白溶液，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)果表明輔料、試劑均無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好.

2)精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算偏差.RSD為0.58%，精密度良好.

3)最低檢測(cè)限、定量限

精密稱(chēng)取青藤堿對(duì)照品2.5 mg，甲醇定容至25 mL，取1 mL定容至10 mL逐級(jí)稀釋?zhuān)凑铡?.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得檢測(cè)限為 0.8 μg/mL，定量限為 2.5 μg/mL.

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱(chēng)取青藤堿對(duì)照品7.05 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為 0.282 mg/mL).取 1、2、4、8 mL 分別置100 mL量瓶中，同時(shí)再取1、2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度.得質(zhì)量濃度分別為0.002 82、0.005 64、0.011 28、0.022 56、0.028 2、0.056 4 mg/mL的對(duì)照品溶液，按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積.以對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)對(duì)峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:y=8×106+1 315.4(R=0.999 9)，結(jié)果表明在 0.002 82～0.056 4 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.

5)準(zhǔn)確度

精密稱(chēng)取青藤堿對(duì)照品約7.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液.分別精密移取儲(chǔ)備液各1 mL及稱(chēng)取適量供試品，共同放置于已有剪碎的大鼠足部的勻漿管中，共9份.按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，使質(zhì)量濃度為測(cè)定質(zhì)量濃度的80%、100%、120%各3份.進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得回收率為100.6%在98% ～102%范圍內(nèi)，RSD為1.9%，證明回收率良好.

6)樣品穩(wěn)定性

按“2.1.3”方法制備供試品，分別放置 0、2、4、8、10、12 h，測(cè)定其峰面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD為1.25%，樣品穩(wěn)定性良好.

2.5 青防腫痛外敷散局部藥動(dòng)學(xué)研究

Wistar大鼠80只，體重180～220 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前 12 h禁食不禁水.將大鼠按“2.1.3”項(xiàng)下方法給藥，每天換藥1次，每天處死4只，連續(xù)定時(shí)取材20 d，測(cè)定每天藥物的吸收情況.采用PKSolver藥動(dòng)學(xué)軟件獲得相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及吸收曲線;AUC0－t為梯形法計(jì)算值，Cssmax、Cmin為實(shí)測(cè)值，平均穩(wěn)態(tài)血藥質(zhì)量濃度(Cssav)為根據(jù)公式Cssav=AUC0－t/t計(jì)算所得，穩(wěn)態(tài)谷質(zhì)量濃度(Cssmin)為實(shí)測(cè)的4個(gè)谷質(zhì)量濃度的平均值，波動(dòng)度(DF)為根據(jù)公式DF(%)=(Cssmax－ Cssmin)/Cssav×100%計(jì)算所得.用SPSS 18.0進(jìn)行成組t檢驗(yàn)的對(duì)照分析.研究結(jié)果見(jiàn)表1、2，圖1、2.

表1 局部吸收藥量測(cè)定結(jié)果(±S)

表1 局部吸收藥量測(cè)定結(jié)果(±S)

注:“—”代表未檢出

時(shí)間/d 動(dòng)物數(shù)/只 組織局部吸收量/mg 百分含量/%4 0.069 3 ±0.009 1 1.71 2 4 0.386 1 ±0.006 5 9.53 3 4 0.282 0 ±0.018 0 6.96 4 4 0.189 4 ±0.0006 4.68 5 4 0.345 9 ±0.010 0 8.54 6 4 0.297 3 ±0.005 7 7.34 7 4 0.229 9 ±0.001 2 5.68 8 4 0.312 6 ±0.019 0 7.72 9 4 0.250 9 ±0.014 0 6.19 10 4 0.219 7 ±0.001 6 5.42 11 4 0.299 7 ±0.001 6 7.40 12 4 0.244 5 ±0.019 0 6.03 13 4 0.186 9 ±0.017 0 4.61 14 4 0.228 1 ±0.001 1 5.63 15 4 0.217 2 ±0.011 0 5.36 16 4 0.171 6 ±0.016 0 4.23 174——184——194——20 4 1——

圖1 局部吸收藥量曲線

圖2 局部吸收藥量擬合曲線

表2 相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

局部給藥與口服給藥相比，僅有少量的藥物被吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，而且由于消除與新陳代謝行為藥物質(zhì)量濃度下降很快[6]，在局部給藥系統(tǒng)中，血漿中藥物質(zhì)量濃度與藥理效應(yīng)沒(méi)有直接關(guān)系，所以本文選擇采用測(cè)定多次給藥后局部病變部位全組織藥物質(zhì)量濃度，來(lái)評(píng)價(jià)外用給藥在給藥部位藥物的動(dòng)態(tài)行為.經(jīng)數(shù)據(jù)擬合及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算可知，藥物穩(wěn)態(tài)后的吸收質(zhì)量濃度范圍為0.21～0.39 mg/mL之間，平均穩(wěn)態(tài)質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL.DF值為75%，波動(dòng)度適宜，未超出治療范圍.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大鼠足部中鹽酸青藤堿的吸收量3 d為一個(gè)波動(dòng)期，13 d以后趨于平衡，至16 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物足部吸收量較少，低于定量限以下.分析其原因可能是本品所用輔料中含有醋酸，長(zhǎng)時(shí)間貼敷給藥，醋酸可使皮膚組織蛋白凝固壞死，增加了皮膚的角質(zhì)化，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象觀察，在連續(xù)給藥16 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥部位已嚴(yán)重角質(zhì)化，不能再繼續(xù)吸收藥物，導(dǎo)致檢測(cè)量較低.

藥物的透皮吸收不同于其他的吸收過(guò)程，藥物從給藥部位進(jìn)入到體循環(huán)要經(jīng)過(guò)一系列的動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此它的吸收不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)，不會(huì)出現(xiàn)明顯的“峰谷”現(xiàn)象[7－8].局部藥動(dòng)學(xué)研究顯示，炎性部位吸收最高藥量出現(xiàn)在給藥后第2天.分析原因在于大部分藥物透過(guò)皮膚去對(duì)抗炎性因子，只有少量的藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，這就證明了鹽酸青藤堿等藥物局部給藥用于治療關(guān)節(jié)炎等類(lèi)疾病的優(yōu)點(diǎn).也就是說(shuō)較少的藥量在局部即可發(fā)揮較強(qiáng)的藥效.此外，鹽酸青藤堿局部給藥的毒副作用在與口服給藥對(duì)比時(shí)易被忽視，所以對(duì)于藥物累計(jì)、質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化等還需要進(jìn)一步具體的研究.

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