范勇杰, 戴海英, 呂 川, 朱 吉, 王宇翀, 趙 輝, 孫夢(mèng)妍, 武 鎧, 薛春雨

建立豚鼠自體全厚皮片移植后色素沉著過(guò)程模型的研究

范勇杰, 戴海英, 呂 川, 朱 吉, 王宇翀, 趙 輝, 孫夢(mèng)妍, 武 鎧, 薛春雨

目的 通過(guò)豚鼠自體全厚皮片植皮后觀察黑色素沉著情況，探究作為自體皮片移植術(shù)后色素沉著模型的理想研究對(duì)象。方法 在3種不同顏色豚鼠行自體全厚皮片移植，觀察黑色素在自體皮片中的沉著過(guò)程。結(jié)果 通過(guò)Masson-Fontana黑色素染色方法和image pro-plus 6.0軟件分析,觀察到黑色、棕黃色豚鼠術(shù)后明顯的皮膚黑色素改變以及黑色素積分光密度/角質(zhì)形成細(xì)胞面積比值在第1、2、3周與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且黑色豚鼠術(shù)后4周與對(duì)照組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而白色豚鼠的植皮后黑色素與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 黑色、棕黃色豚鼠可作為研究自體全厚皮片移植后黑色素沉著的動(dòng)物模型。

自體全厚皮片移植; 豚鼠; 色素沉著

自體全厚皮片移植是整形外科常見(jiàn)手術(shù)，能很好地建立皮膚屏障功能，尤其在關(guān)節(jié)處能改善患者肢體運(yùn)動(dòng)功能。然而在臨床中我們發(fā)現(xiàn)，自體全厚皮片移植后植皮區(qū)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)比正常的皮膚顏色更深的色素沉著[1]。目前研究皮膚黑色素的動(dòng)物模型主要有斑馬魚(yú)、Smyth line雞、C57BL小鼠和豚鼠[2-5]、皮膚美白化妝品藥物試驗(yàn)。自2014年5～11月，我們通過(guò)對(duì)豚鼠行自體全厚皮片植皮后觀察黑色素沉著情況，探究作為自體皮片移植術(shù)后色素沉著模型的理想研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 Masson-Fontana黑色素染色液：A試劑(氨銀溶液)，B試劑(天青石藍(lán)溶液)，C試劑(中性紅溶液)(由江蘇南京森貝伽公司提供)。1%戊巴比妥鈉，HE染色試劑(由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，石蠟切片機(jī),奧林巴斯PB840正置熒光顯微鏡(長(zhǎng)海醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，佳能600D單反相機(jī)，EF 18-75鏡頭。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通健康成年雄性Hartly 豚鼠，白色、黑色、棕黃色各10只，體質(zhì)量300～650 g，平均431.4 g(由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?將白色、黑色、棕黃色豚鼠按顏色分成3組，標(biāo)記為甲組、乙組、丙組，每組10只。按體質(zhì)量大小編號(hào),12 h自然光并避免陽(yáng)光直射，12 h避光飼養(yǎng)。術(shù)前禁食水 6～8 h，1%戊巴比妥鈉按45 mg/kg腹腔注射麻醉后，機(jī)械脫毛，仰臥位固定豚鼠四肢，術(shù)區(qū)常規(guī)乙醇消毒，鋪無(wú)菌巾單。于腹部臍上2.0 cm處距中線兩側(cè)2.0 cm處，各取約2.5 cm×2.5 cm全層皮膚，并將創(chuàng)面下的淺筋膜層做部分切除，克氏針在乙醇燈下加熱，創(chuàng)面止血，所取供區(qū)皮片修剪掉皮下淺筋膜為全厚皮片，交換至對(duì)側(cè)覆蓋于創(chuàng)面， 1號(hào)編織線縫合，凡士林紗布覆蓋術(shù)區(qū)，無(wú)菌紗布內(nèi)置無(wú)菌棉花加壓包扎，術(shù)后5 d拆包，7 d拆線。期間，2只白色豚鼠，1只黑色豚鼠，2只棕黃色豚鼠死亡，均退出實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 于術(shù)后1、2、3周，1、2、3個(gè)月，在植皮區(qū)距創(chuàng)緣10 mm無(wú)炎癥反應(yīng)處取5 mm×5 mm植皮皮片，對(duì)照皮片取非手術(shù)原供區(qū)附近全層皮膚。將所取標(biāo)本行10%甲醛固定24 h，梯度脫水后石蠟包埋，切片按皮膚由表及里方向橫切，厚度約5 μm；分成2份，一份行HE常規(guī)染色，一份行Masson-Fontana黑色素染色。鏡下觀察黑色素分布情況，并在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組不同時(shí)間與本組自身均值對(duì)照，行配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 觀察結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后3 d，內(nèi)皮膚水腫明顯，失去光澤，植皮區(qū)皮片顏色變暗；5 d后，植皮區(qū)表皮顏色發(fā)暗，稍變干燥；7 d左右，皮片成活，可見(jiàn)植皮區(qū)縫線四周表皮開(kāi)始脫落；14 d時(shí)，大部分植皮區(qū)陳舊表皮已脫落干凈，顯露出植皮區(qū)新嫩表皮，但無(wú)明顯毛發(fā)生長(zhǎng)；3周左右，植皮區(qū)靠近中心區(qū)毛發(fā)叢樣生長(zhǎng)，并向創(chuàng)緣處延伸；4周左右植皮區(qū)大部分顏色大致恢復(fù)致術(shù)前；2、3個(gè)月，未見(jiàn)植皮區(qū)明顯加深和減弱。

2.2 鏡下觀察 在光學(xué)顯微鏡下觀察，白色豚鼠術(shù)后植皮區(qū)及對(duì)照皮片僅能在基底細(xì)胞層和毛囊中偶見(jiàn)黑色素顆粒，并未見(jiàn)明顯增多趨勢(shì)。棕黃色、黑色豚鼠植皮后1周時(shí)，較對(duì)照組黑色素減少，術(shù)后2周達(dá)到高峰，2周后，黑色素?cái)?shù)量漸漸增多，4周時(shí)，與對(duì)照組皮片黑色素含量接近。

3 檢測(cè)指標(biāo)

每個(gè)標(biāo)本切3張切片，每張片子隨機(jī)拍照10張。要求對(duì)標(biāo)本采用相同的處理手段，包括組織包埋大小、切片厚度，染色過(guò)程，并保持所有切片拍照環(huán)境一致；包括選擇同一倍數(shù)下，統(tǒng)一光照、曝光時(shí)間，使空白對(duì)照處達(dá)到灰度值230左右。采用image pro-plus 6.0軟件對(duì)拍攝照片進(jìn)行分析，檢測(cè)黑色素包括切片中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞、毛發(fā)中所含黑色素，同時(shí)檢測(cè)含有黑色素組織的面積，包括表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞、毛發(fā)等的面積(area of melanin-containing tissues, AMT)。計(jì)算黑色素積分光密度(integrated option density, IOD)/AMT。設(shè)計(jì)宏對(duì)每張照片做相同處理。

4 結(jié)果

黑色、棕黃色豚鼠黑色素IOD/AMT在植皮后第1、2、3周與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且黑色豚鼠術(shù)后1個(gè)月與對(duì)照組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白色豚鼠術(shù)后植皮區(qū)黑色素IOD/AMT與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。使用GraphPadPrism6.01軟件，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果制成圖表。

黑色豚鼠的皮膚黑色素含量較棕黃色、白色豚鼠多，依照?qǐng)D1～3可知，使用imagepro-plus6.0軟件檢測(cè)時(shí)，黑色素光密度/表皮細(xì)胞面積值較棕黃色和白色豚鼠高，在植皮后1周，棕黃色、黑色豚鼠黑色素IOD/AMT均降低，術(shù)后2周達(dá)到最低點(diǎn)，從第3周開(kāi)始上升，棕黃色豚鼠于術(shù)后4周，達(dá)到術(shù)前水平，黑色豚鼠于術(shù)后8周，到達(dá)術(shù)前水平。白色豚鼠植皮后，皮膚顏色變化不大。棕黃色和黑色豚鼠符合植皮后早期創(chuàng)面修復(fù)時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞受到損傷及黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降的表現(xiàn)。2周時(shí)，植皮區(qū)表皮和毛發(fā)脫落接近完全，使皮膚中的黑色素IOD/AMT降至最低，3周左右毛發(fā)開(kāi)始生長(zhǎng)，黑色素IOD/AMT開(kāi)始上升，在第4周時(shí)達(dá)到正常水平。白色豚鼠因?yàn)樽陨砥つw中黑色素含量較少，在植皮術(shù)中下降和上升趨勢(shì)不明顯，故黑色素IOD/AMT與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 討論

皮膚色素主要受幾方面影響：食物來(lái)源的胡蘿卜素、皮膚的血紅蛋白、含鐵血黃素、黑色素等，其中黑色素在皮膚色素沉著中占最重要的作用，黑色素由黑色素細(xì)胞合成，在皮膚表皮中沉著呈現(xiàn)“核上帽”能有效避免紫外線對(duì)皮膚細(xì)胞核DNA的損傷。皮膚的顏色由黑色素顆粒的數(shù)量決定，而不是由黑色素細(xì)胞的數(shù)量決定[6]，自體皮片移植后出現(xiàn)的色素沉著主要為黑色素在表皮基底層的大量蓄積。對(duì)于動(dòng)物模型豚鼠膚色的選擇，目前文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)明確的標(biāo)準(zhǔn)，選用花色豚鼠作為研究對(duì)象為多[7-9]，在紫外線色素沉著誘導(dǎo)方面，一般選用棕黃色豚鼠[3]。1994年，李海洋等采用黑色豚鼠背部?jī)蓚?cè)自體皮片移植觀察色素變化，忽視了皮膚色素受可見(jiàn)光尤其是紫外線的影響；秦瑤等[3]采用雌性豚鼠觀察色素沉著，忽視了雌激素對(duì)皮膚色素的影響。我們采用雄性純色豚鼠腹部植皮，一是可以確保全身色素均勻；二是確保排除雌激素對(duì)皮膚色素的影響；三是將腹部植皮區(qū)避免可見(jiàn)光照射，去除紫外線對(duì)皮膚色素的影響；四是可以避免因背部皮膚過(guò)厚，血運(yùn)不足而導(dǎo)致植皮后存活困難。先前人們對(duì)皮膚色素沉著的黑色素含量判斷主要是計(jì)數(shù)法，這種方法人為因素大，主觀性較強(qiáng)。目前，采用計(jì)算機(jī)圖片處理工具軟件image pro-plus 6.0很好的克服了人為主觀判斷帶來(lái)的誤差，將黑色素觀察進(jìn)行量化，但是此法對(duì)拍照要求高，初學(xué)者不容易掌握。

圖1 白色豚鼠植皮區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)黑色素積分光密度/含黑色素組織面積的影響 圖2 棕黃色豚鼠植皮區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)黑色素積分光密度/含黑色素組織面積的影響 圖3 黑色豚鼠植皮區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)黑色素積分光密度/含黑色素組織面積的影響

Fig 1 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of white guinea pigs skin transplantation. Fig 2 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of brown guinea pigs skin transplantation. Fig 3 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of black guinea pigs skin transplantation.

黑色或棕黃色豚鼠植皮后黑色素恢復(fù)沉著，大致需要1～2個(gè)月，黑色素平均光密度的增加必然是黑色素沉著的表現(xiàn)。植皮后皮片存活的過(guò)程也是創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程,其中包含了大量炎癥因子和創(chuàng)面修復(fù)因子的共同作用[10-11]。另外，角質(zhì)形成細(xì)胞的加速脫落，說(shuō)明角質(zhì)形成細(xì)胞在術(shù)后加速增殖，而角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)黑色素沉著的作用亦非常重要[12-13]。如何抑制黑色素在自體皮片移植后皮膚的黑色素沉著是臨床醫(yī)師的棘手問(wèn)題，建立一種研究黑色素沉著的動(dòng)物模型，可以為臨床研究皮膚黑色素沉著的機(jī)制提供研究平臺(tái)。純黑色或純棕黃色豚鼠可作為理想的自體全厚皮片移植后黑色素沉著動(dòng)物模型。

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Research about the model of pigmentation after autologous full-thickness skin transplantation on guinea pigs

FANYong-jie,DAIHai-ying,LYUChuan,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To observe the pigmentation after autologous full-thickness skin transplantation on guinea pigs, researching an ideal animal model of pigmentation. Methods Autologous full-skin transplantation was performed on 3 different color of guinea pigs and the processing of pigmentation was observed then. Results By Masson-Fontana stain and soft image pro-plus 6.0 analysis on the black and brown guinea pigs, the changes of skin melanin and the ratio of melanin IOD and keratinocyte area had the statistically significant differences at 1, 2 and 3 weeks after operation comparing with the control group (P<0.05)；furthermoretheblackguineapigsalsohadstatisticallysignificantdifferencesat4weeks(P<0.05),butthewhiteguineapigshadnostatisticallysignificantdifferencesallthetime. Conclusion Black and brown guinea pigs are ideal models to research the pigmentation process after full-thickness skin transplantation.

Autologous full-thickness transplantation ; Guinea pig; Pigmentation

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科

范勇杰(1986-)，男，浙江湖州人，醫(yī)師，碩士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.013

R

A

1673-7040(2015)04-0228-03

2014-12-06)