王興蕊，歐陽慧子，竇　婷，薄　芳，屠亞茹，何　俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

·中藥研究·

LC-MS法測定大鼠血漿中甘草次酸及其藥動學(xué)研究*

王興蕊1，歐陽慧子2，竇婷，薄芳1，屠亞茹1，何俊1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）的方法測定大鼠口服三拗湯后甘草次酸的藥代動力學(xué)。［方法］采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（含10 mmol/L甲酸銨），90%乙腈等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL。采用電噴霧離子源，SIM負(fù)離子檢測模式，甘草次酸和熊果酸（內(nèi)標(biāo)）定量離子分別為m/z 469.4和m/z 455.4。大鼠單劑量灌胃給予三拗湯濃縮液后，經(jīng)液-液萃取法對大鼠血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理，利用LC-MS法測定大鼠體內(nèi)甘草次酸的血藥濃度，并采用DAS（ver．1．0）軟件計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。［結(jié)果］甘草次酸的線性范圍為5～10 000 μg/L，最低定量限為5 μg/L，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾甘草次酸及內(nèi)標(biāo)的測定，方法精密度、準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣品的測定要求。［結(jié)論］本方法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、靈敏度好的特點(diǎn)，可用于甘草次酸的藥代動力學(xué)研究。

三拗湯；甘草次酸；藥物代謝動力學(xué)

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.10

三拗湯出自張仲景撰寫的《金匱要略》，方藥主要由麻黃、杏仁和甘草3種成分組成，具有宣肺解表、止咳平喘的功效，可用于治療外感風(fēng)寒、肺氣不宣、頭痛目眩、痰多咳嗽等癥［1-7］。方中甘草具有祛痰、止咳等作用，其主要化學(xué)成分有甘草酸、甘草多糖及甘草黃酮等，其中甘草酸具有清熱解毒、潤肺止咳等作用［8-11］，為甘草的藥效成分，其在生物體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為甘草次酸。甘草次酸具有中樞性鎮(zhèn)咳作用，此外，還有抗腫瘤以及抗病毒感染的作用［12-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）的方法測定大鼠血漿中甘草次酸的血藥濃度，并對大鼠灌胃給予三拗湯濃縮液后甘草次酸的藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究。

1　儀器與材料

1.1儀器API 3200三重四級桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源、Analyst Software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；Agilent 1200高效液相色譜儀；梅特勒-托利多AX 205分析天平（瑞士）；XW-80 A型微型渦旋混勻器（上海滬西分析儀器廠）；高速離心機(jī)（Beckman）；KQ-250 E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（Millipore）。

1.2材料甘草次酸（購自中國食品藥品檢定研究院，批號MUST-14082210，純度≥98%）；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號110742-200415，純度≥98%）；乙腈（色譜純，購自Fisher公司）；甲醇（色譜純，購自TEDIA公司）；甲酸銨（分析純，購自天津市天河化學(xué)試劑廠）；乙酸乙酯（分析純，購自天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；超純水為Milli-Q制備。

1.3動物雄性SD大鼠8只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證編號0163041。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件AgilentZorbaxSB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，Agilent Zorbax C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）保護(hù)柱；流動相：乙腈-10 mmol/L甲酸銨水溶液（90∶10；V/V），流速：0.3 mL/min，等度洗脫，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI源），SIM負(fù)離子檢測模式。Curtain Gas為15 psi；IonSpray Vottage為-4 500 V；Temperature為350℃；GS1為40 psi、GS2為60 psi；甘草次酸的定量離子為m/z 469.4，DP為-85.5；EP為-10；熊果酸（內(nèi)標(biāo)）的定量離子為m/z 455.4，DP為-88.2；EP為-10。

2.3對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，分別采用甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，作為儲備液。精密吸取一定量的甘草次酸儲備液用乙腈稀釋為10 mg/L的工作液，同樣，采用乙腈稀釋熊果酸儲備液為400 μg/L的工作液。所有的儲備液和工作溶液均保存在-20℃的冰箱中。

2.4供試品溶液的制備分別稱取麻黃、杏仁、甘草各9 g，加入220 mL蒸餾水，煎煮60 min后將藥液濾出，剩余藥渣加水160 mL繼續(xù)煎煮60 min，合并藥液并濃縮至18mL，儲存于-20℃冰箱中備用。

2.5血漿樣品處理方法精密量取血漿樣品100 μL，依次加入100 μL乙腈，100 μL內(nèi)標(biāo)溶液（400 μg/L的熊果酸溶液），800 μL乙酸乙酯，渦旋2 min，12 000 g離心5 min，吸取上清液900 μL，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，采用流動?00 μL復(fù)溶，超聲1 min，13 000 g離心5 min，吸取上清液，20 μL進(jìn)行LCMS分析。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1專屬性考察精密量取6份100 μL空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“2.5”項(xiàng)下處理并吸取上清進(jìn)樣分析，得色譜圖A。另取6份100 μL空白血漿，配制成含100 μg/L甘草次酸，依同法處理并吸取上清進(jìn)樣分析，得色譜圖B。取大鼠給藥后血漿樣品依同法處理并吸取上清進(jìn)樣分析，得色譜圖C。其中甘草次酸和內(nèi)標(biāo)熊果酸的保留時間分別為3.21 min和4.79 min。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾甘草次酸和內(nèi)標(biāo)的測定。見圖1。

2.6.2精密度與準(zhǔn)確度精密量取100 μL大鼠空白血漿，加入甘草次酸對照品溶液適量，配制成含甘草次酸濃度為10、100、1000μg/L的低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品（QC）各5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，連續(xù)測定3 d，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行測定，記錄甘草次酸的峰面積，計(jì)算QC樣品的測定濃度，與配制濃度對照，求得方法的準(zhǔn)確度，并計(jì)算方法的日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果甘草次酸的日內(nèi)精密度RSD值分別為4.1%、1.8%、7.2%；日間精密度RSD值分別為4.8%、1.9%、5.2%，所得結(jié)果均小于15%，符合生物樣品的測定要求。結(jié)果見表1。

表1　大鼠血漿中甘草次酸的日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度（n=5）

圖1　LC-MS法色譜圖

2.6.3提取回收率精密吸取100 μL空白血漿，分別加入100 μL低、中、高3種濃度的甘草次酸對照品溶液，按“2.5”進(jìn)行處理與測定，測得甘草次酸峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣測定的低、中、高3個濃度的甘草次酸對照品溶液比較，每個濃度平行操作5份，則甘草次酸低、中、高濃度的提取回收率分別為（79.0±1.2）%、（66.6±1.2）%、（66.4±1.8）%，其RSD值分別為1.6%、1.8%、2.6%。

2.6.4基質(zhì)效應(yīng)精密量取100 μL空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.5”項(xiàng)下處理操作，取上清并分別加入一定量的低、中、高3個濃度的甘草次酸對照品及內(nèi)標(biāo)溶液各3份，并進(jìn)行測定，其甘草次酸的峰面積與相同濃度的甘草次酸對照品溶液峰面積比較，得甘草次酸低、中、高3個濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為（105.9±4.9）%、（101.2±3.2）%、（103.2±5.8）%；內(nèi)標(biāo)熊果酸的基質(zhì)效應(yīng)為（96.3±3.9）%，結(jié)果在85%～115%之內(nèi)。表明本方法測定條件下血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對甘草次酸的測定基本沒有影響。

2.6.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密量取100 μL空白血漿，分別配制為低、中、高3種濃度的血漿樣品各3份，按“2.5”項(xiàng)下處理分析，分別考察了甘草次酸在室溫條件下放置0、12、24 h，-20℃冰箱冷凍放置0、3、7 d，反復(fù)凍融1、2、3次的穩(wěn)定性。測定結(jié)果的準(zhǔn)確度在96.5%～113.6%之間，RSD值均小于15%。表明甘草次酸在上述條件下處理穩(wěn)定性良好。

2.7藥動學(xué)研究取8只SD雄性大鼠，于給藥前禁食12 h以上，飲水自由。大鼠灌胃給予三拗湯全方濃縮液，給藥劑量為9 mL/kg，分別于給藥前及給藥后1、2、3、4、5、6、8、10、11、12、13、24、36、48 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢取血0.3 mL，置已肝素化的離心管中，4 000 g離心10 min，取血漿100 μL按“2.5”處理并進(jìn)樣，測定血藥濃度，繪制平均藥時曲線，結(jié)果見圖2。采用DAS（ver．1．0）軟件進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算甘草次酸的藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2　大鼠給藥三拗湯后甘草次酸藥動學(xué)參數(shù)（±s）

表2　大鼠給藥三拗湯后甘草次酸藥動學(xué)參數(shù)（±s）

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3　討論

實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源，對GS1、GS2、DP和EP等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化［15］。對甘草次酸進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描時，主要獲得其去質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-峰，在不同的碰撞能量下甘草次酸的二級質(zhì)譜可產(chǎn)生m/z 425.2和m/z 355.3的碎片離子峰，但強(qiáng)度較弱。在實(shí)際血漿樣品測定時采用一級離子檢測即可，血漿樣品在甘草次酸出峰處無干擾，且離子響應(yīng)好。內(nèi)標(biāo)物熊果酸在對其進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描時，主要獲得其去質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-峰，熊果酸較難裂解成二級離子。故實(shí)驗(yàn)選用SIM掃描方式對甘草次酸進(jìn)行定量測定。

血漿樣品采用甲醇或乙腈沉淀蛋白，或沉淀蛋白后氮?dú)獯蹈傻姆椒ǘ紩Ω什荽嗡岙a(chǎn)生干擾［16］，且固相萃取檢測成本較高。所以本實(shí)驗(yàn)最終采用液-液萃取法對甘草次酸的血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理，簡單萃取后即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)測定要求［17］。

甘草中甘草酸是含量最高的苷類化合物，主要由順式甘草酸和少量反式甘草酸組成［18-19］。在生物體內(nèi)甘草酸經(jīng)胃酸水解或經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶分解成甘草次酸。甘草次酸可在肝腸循環(huán)中經(jīng)腸內(nèi)菌作用而發(fā)生藥物活性，其活性較甘草酸更強(qiáng)。甘草次酸具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗心律失常以及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用［20-22］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠灌胃三拗湯濃縮液后，甘草次酸在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程符合一室模型，并于給藥后10～13 h后達(dá)峰，且消除緩慢，給藥后48 h后仍能檢測得到。

圖2　大鼠單次灌胃給藥三拗湯濃縮液后甘草次酸血漿藥物濃度時間曲線（n=8）

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Method of LC-MS for the determination of glycyrrhetinic acid in rat plasma and pharmacokinetic study of glycy rrhetinic acid

WANG Xing-rui1，OUYANG Hui-zi2，DOU Ting1，BO Fang1，TU Ya-ru1，HE Jun1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To develop a LC-MS method for the pharmacokinetic study of glycyrrhetinic acid after administration of Sanao decoction.［Methods］The method of determination was performed on Agilent Zorbax SBC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）column using acetonitrile and water containing of 10 mM Ammonium formate as mobile phase in isocratic elution with 90∶10.The flow rate was 0.3 mL/min and the temperature was 25℃. Electrospray ionization（ESI）source was applied and operated in the negative ion mode with SIM scanning mode.The quantitative ions of glycyrrhetinic acid and ursolic acid were m/z 469.4 and m/z 455.4.Rats were oral administration with single dose Sanao decoction concentrated solution.The plasma samples were through liquid-liquid extraction pretreatment.Using the method of LC-MS for the determination of plasma concentration of glycyrrhetinic acid and calculate the pharmacokinetic parameters by DAS（ver.1.0）.［Results］The linear rang of glycyrrhetinic acid was 5～10 000 ng/mL and it's limit of quantity was 5 ng/mL.Endogenous substances did not interfere with the determination of glycyrrhetinic acid and internal standard.The methods of precision，accuracy，recovery and stability are in line with the requirements of determination of biological samples and may be applied for glycyrrhetinic acid pharmacokinetic study.［Conclusion］The method has the characteristics of high specificity，high accuracy，good sensitivity，and can be used for glycyrrhetinic acid pharmacokinetic study.

Sanao decoction；glycyrrhetinic acid；pharmacokinetic

R285.5

A

1673－9043（2015）04－0229-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303140）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20131210120015）。

王興蕊（1989－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

何俊，E-mail：hejun673@163.com。

（2015-04-15）