馬萌萌，胡利民，王喬悅，楊紅云，王旭梅，郭　虹

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津300193）

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心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機制研究*

馬萌萌，胡利民，王喬悅，楊紅云，王旭梅，郭虹

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津300193）

［目的］研究心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機制。［方法］體外培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞，分為正常對照組、缺氧/復(fù)氧損傷模型組、心腦舒通（10、25、50 mg/L）給藥組，建立缺氧缺糖（OGD）4 h/復(fù)氧復(fù)糖（Rep）24 h損傷模型，檢測心腦舒通對各組細(xì)胞增殖活力、乳酸脫氫酶（LDH）漏出量、活性氧（ROS）水平和線粒體膜電位（△Ψm）的影響。［結(jié)果］與缺氧/復(fù)氧組比較，心腦舒通可以明顯增加Neuro-2a細(xì)胞活力，減少LDH漏出，降低ROS水平，增強線粒體膜電位。［結(jié)論］心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用，其機制與其影響活性氧水平和線粒體膜電位有關(guān)。

心腦舒通；神經(jīng)保護(hù)；缺氧/復(fù)氧；Neuro-2a細(xì)胞

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.14

心腦舒通為蒺藜植物地上部分有效部位的提取物，其主要成分是蒺藜總皂苷，具有活血化瘀，舒利血脈的藥理作用［1］?，F(xiàn)代研究表明蒺藜皂苷具有抗腫瘤、提高耐缺氧能力、增強免疫功能、保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心肌、抗腦缺血等作用［2］，其中抗腦缺血這一作用與其降低血小板聚集性及抗凝血有關(guān)［3］。臨床研究也證實，心腦舒通可以改善血液流變性，改善缺血性心腦血管組織的供血，對預(yù)防和治療缺血性心腦血管疾病具有良好的應(yīng)用前景［4-7］。但近年來對其藥理研究較少，對其作用機制尚不明確。因此本實驗采用缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞模型，初步探討心腦舒通的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機制。

1　材料

1.1藥物與試劑小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞株Neuro-2a，北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；心腦舒通，吉林敖東股份有限公司（批號Z22021965）；MEM培養(yǎng)液，Hyclone公司；胎牛血清（FBS），BI公司；Cell Counting Kit（CCK-8），日本同仁化學(xué)研究所；活性氧檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國Thermo公司；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司；全自動生化分析儀，日本東芝公司。

2　方法

2.1Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)與處理Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 g/L鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺的MEM完全培養(yǎng)基中。將處于對數(shù)生長期的Neuro-2a細(xì)胞消化并吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升4×105個接種于96孔板中。細(xì)胞分組及處理如下：1）正常對照組：將完全培養(yǎng)基替換為MEM培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)4 h后，替換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。2）缺氧/復(fù)氧損傷模型組：將完全培養(yǎng)基替換為DHank’s平衡鹽溶液，置于充滿95%N2-5%CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h后，置換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。3）心腦舒通給藥組：將完全培養(yǎng)基分別置換為含有不同濃度心腦舒通（10、25、50 mg/L）的D-Hank’s溶液，置于充滿95%N2-5%CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h后，再分別置換為含不同濃度心腦舒通（10、25、50 mg/L）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2細(xì)胞活力、LDH漏出量檢測細(xì)胞分組處理后，收取上清液，全自動生化儀測定上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的含量。培養(yǎng)板中每孔加入100 μL含10%CCK-8的MEM培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，酶標(biāo)儀450 nm波長檢測各孔吸光度（A）。

2.3活性氧水平檢測細(xì)胞分組處理后，棄去上清液，細(xì)胞用MEM洗滌3次，每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋的DCFH-DA，使終濃度為10 μg/L。37℃避光孵育20 min，MEM洗滌細(xì)胞3次，酶標(biāo)儀488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長測定熒光強度值。

2.4線粒體膜電位檢測細(xì)胞分組處理后，棄去上清液，細(xì)胞用MEM洗滌3次，每孔加入100 μL 1∶500稀釋的JC-1，37℃避光孵育20 min，MEM洗滌細(xì)胞3次，酶標(biāo)儀490 nm激發(fā)波長，530 nm發(fā)射波長測定JC-1單體熒光強度值，525 nm激發(fā)波長，590 nm發(fā)射波長測定JC-1聚合物熒光強度值，結(jié)果用JC-1聚合物與JC-1單體熒光強度比值表示。

2.5統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊用Dunnetts’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活力、LDH漏出量的影響與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧損傷模型組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），LDH漏出量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，心腦舒通25、50 mg/L組可以顯著增加細(xì)胞活力（P＜0.01），減少LDH漏出量（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1　心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活力、LDH漏出量的影響（x±s）

3.2對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活性氧水平、線粒體膜電位的影響與正常對照組比較，缺氧/復(fù)氧損傷模型組活性氧（ROS）水平顯著升高（P＜0.05），線粒體膜電位明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，心腦舒通10、25、50mg/L組均可顯著降低ROS水平（P＜ 0.05），且25、50 mg/L組還可明顯增加線粒體膜電位（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2　心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活性氧、細(xì)胞線粒體膜電位水平的影響（±s）

表2　心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活性氧、細(xì)胞線粒體膜電位水平的影響（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。與模型組比較，#P＜0.05。

4　討論

近年來有研究表明，心腦舒通可改善血液流變性、促進(jìn)腦血循環(huán)及微循環(huán)、防止心腦血管并發(fā)癥，臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病及中風(fēng)后遺癥的預(yù)防和治療［8-10］。藥理實驗研究證實，心腦舒通可以改善微管蛋白和微管結(jié)合蛋白的表達(dá)，維護(hù)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)［11］；有效調(diào)控急性腦缺血再灌注病理過程中的血管新生，促進(jìn)病理損傷的修復(fù)［12］；改善大鼠皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺的紊亂［13］；增高氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞NF-κB水平；改善AD大鼠空間記憶障礙［14］。腦缺血再灌注損傷還會引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)發(fā)生［15-16］，心腦舒通可以降低腦組織和血清內(nèi)白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量［17］，調(diào)控凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，降低腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率［18］。本文探討了心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞增殖活力、乳酸脫氫酶（LDH）漏出量、活性氧簇水平和線粒體膜電位（△Ψm）的影響。

在正常情況下細(xì)胞內(nèi)LDH的漏出量很低，但細(xì)胞受到損傷后由于細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變，細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH會顯著增多。在腦缺血再灌注損傷過程中神經(jīng)細(xì)胞損傷，會產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），ROS包括氧的單電子還原產(chǎn)物（O-、、OH）、氧的雙電子還原物（H2O2）、烷烴過氧化物均裂產(chǎn)物（RO°、ROO°）、處于激發(fā)態(tài)的氧、單線態(tài)氧和羰基化合物等。ROS可滅活細(xì)胞內(nèi)重要的酶及蛋白、破壞膜結(jié)構(gòu)使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變、直接氧化損傷DNA分子造成細(xì)胞損傷［19］。線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志之一［20-21］。

本實驗結(jié)果證實心腦舒通25、50 mg/L組可以明顯增加缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞活力、減少LDH漏出量；心腦舒通10、25、50 mg/L組可顯著降低細(xì)胞ROS水平；心腦舒通25、50 mg/L組可顯著提高線粒體膜電位。表明心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機制與其影響活性氧水平和線粒體膜電位有關(guān)，這一結(jié)果為更深入研究心腦舒通的神經(jīng)保護(hù)作用奠定了一定基礎(chǔ)。

［1］盧國彥，楊紅云，王少峽，等.心腦舒通及其單體成分對內(nèi)毒素激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，33（1）：19-21.

［2］齊建紅.蒺藜皂苷的藥理作用研究新進(jìn)展［J］.西安文理學(xué)院學(xué)報，2013，16（3）：26-29.

［3］王秀華，李紅，溫克，等.注射用蒺藜皂苷的抗腦缺血作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報，2004，30（1）：60－62.

［4］曲晶.心腦舒通膠囊的臨床應(yīng)用綜述［J］.藥物研究，2012，8（7）：60.

［5］秦鼎，李豐升，陳俊紅.心腦舒通膠囊治療中風(fēng)后遺癥78例臨床觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（11）：1327-1328.

［6］王寧.心腦舒通膠囊對急性腦梗死病人GMP-40、D-二聚體及血小板聚集率的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（7）：808-809.

［7］張允嶺，劉超，劉雪梅，等.心腦舒通膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦微循環(huán)調(diào)節(jié)活性物質(zhì)變化的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，32（7）：450-453.

［8］宋彥君.心腦舒通膠囊治療慢性腦供血不足療效觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（9）：1055-1057.

［9］于春巖，彭麗莉，于靜遠(yuǎn).心腦舒通膠囊治療高黏血癥的臨床觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7（10）：1160，1260.

［10］劉志堅.心腦舒通膠囊治療中風(fēng)后遺癥臨床觀察［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（7）：59-60.

［11］劉雪梅，張允嶺，柳洪勝.心腦舒通膠囊對大鼠缺血再灌注腦損傷后細(xì)胞骨架的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（8）：1726-1729.

［12］張允嶺，劉超，劉雪梅.腦舒通膠囊對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26（3）：587-589.

［13］陶冶，張允嶺，劉超，等.心腦舒通膠囊對急性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：503-505.

［14］王永斌，甘云波.蒺藜總皂苷對AD大鼠的影響［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報，2011，25（5）：379-381.

［15］王萍，張密霞，莊朋偉，等.腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機制研究進(jìn)展［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，33（5）：317-320.

［16］景浩然，楊紅云，王少峽，等.大黃酚對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，2（3）：148-150.

［17］劉雪梅，張允嶺，柳洪勝，等.心腦舒通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷后IL-1β、TNF-α與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（10）：870-873.

［18］張允嶺，劉雪梅，柳洪勝，等.心腦舒通膠囊對大鼠缺血再灌注腦損傷后細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國中藥雜志，2008，33（10）：1188-l191.

［19］郭碧花.活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機理的研究進(jìn)展［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，17（4）：166-169.

［20］Choi DW.Ischemia-induced neuronal apoptosis［J］.Current Opinion in Neurobiolgy，1996，6：667-672.

［21］Moskowitz MA，Lo EH，Iadecola C.The science of stroke：mechanismsin search of treatments［J］.Neuron，2010，67（2）：181-198.

Protective effect of Xinnao Shutong on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells and its mechanism

MA Meng-meng，HU Li-min，WANG Qiao-yue，YANG Hong-yun，WANG Xu-mei，GUO Hong
（Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the protective effect of Xinnao Shutong on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells and its mechanism.［Methods］Neuro-2a cells were cultured in vitro，divided into control，model，low-dose，mid-dose and high-dose Xinnao Shutong（10、25、50 g/mL）groups.Establishmenting OGD 4 h/Rep 24 h damage model，detecting cell viability，lactate dehydrogenase（LDH）leakage，reactive oxygen species（ROS）level and mitochondrial membrane potential（△Ψm）.［Results］Compared with model group Xinnao Shutong can significantly increase the Neuro-2a cell activity，reduce the leakage of LDH，decrease the level of ROS，enhance the mitochondrial membrane potential.［Conclusion］Xinnao Shutong has obvious protective effect on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells，and the mechanism is related to influence ROS level and mitochondrial membrane potential on Neuro-2a.

Xinnao Shutong；neuroprotection；hypoxia/reoxygenation；Neuro-2a

R285.5

A

1673-9043（2015）04-0245-03

國家科技重大專項項目-重大新藥創(chuàng)制（2011ZX 09201）；“十二五”期間天津市高等學(xué)校“創(chuàng)新團(tuán)隊培養(yǎng)計劃”（TD12-5035）。

馬萌萌（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥神經(jīng)藥理研究。

郭虹，E-mail：cacti1983@163.com。

（2015-03-14）