李元元，江振作，張蕾，柴欣，王躍飛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

UPLC-Q-TOF/MS法鑒定大鼠體內(nèi)甘草素的代謝產(chǎn)物*

李元元1，2，江振作1，2，張蕾1，2，柴欣1，2，王躍飛1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

［目的］研究甘草素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。［方法］采用靜脈注射（iv）、灌胃（ig）兩種給藥方式，劑量20 mg/kg，收集大鼠血漿、尿液、糞便、膽汁，應(yīng)用UPLC-Q-TOF/MS法鑒定甘草素的代謝產(chǎn)物。［結(jié)果］血漿、尿液、糞便、膽汁樣品中共鑒定15種代謝產(chǎn)物，主要有異甘草素、（異）甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物、二氫異甘草素、二氫異甘草素硫酸結(jié)合物、異甘草素甲基化及甘草素脫氫的代謝產(chǎn)物；其主要代謝途徑為異構(gòu)化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、甲基化、脫氫反應(yīng)。［結(jié)論］構(gòu)建的UPLC-Q-TOF/MS法可用于大鼠體內(nèi)甘草素代謝產(chǎn)物的研究。

甘草素；代謝產(chǎn)物；UPLC-Q-TOF/MS；異構(gòu)化；葡萄糖醛酸化；硫酸化

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖；性味甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳等功效［1］。甘草素是甘草黃酮的代表性成分，具有抗炎、抑制急性肝損傷、抗腫瘤等作用［2-4］。甘草素的活性及藥效與其體內(nèi)代謝過程密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究甘草素體內(nèi)代謝特征，分離制備甘草素體內(nèi)代謝產(chǎn)物，本實驗采用靜脈注射（iv）、灌胃（ig）兩種給藥方式，應(yīng)用UPLC-Q-TOF/MS法鑒定大鼠給藥后血漿、尿液、糞便、膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物，共鑒定15種代謝產(chǎn)物。為甘草素代謝產(chǎn)物的制備，同時也為甘草中其他黃酮類成分代謝研究提供有益借鑒。

1　材料

1.1儀器ACQUITYTMUPLC-Xevo G2-S液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司，MassLynx V4.1色譜工作站）；十萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：XS205）；渦旋混合儀（德國IKA公司，型號：VORTEX GENIUS3）；真空離心濃縮儀（德國Eppendorf公司，型號：Concentrator plus）；高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TGL-16C）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-2000）；超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，型號：HS615OD）；大鼠代謝籠（意大利TECNIPLAST公司）。

1.2試藥甘草素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：131102）；乙腈、甲醇（SIGMA-ALDRICH公司，色譜純）；甲酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，色譜純）；聚乙二醇400、D101大孔吸附樹脂、95%乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；氯化鈉注射液（河北天成藥業(yè)股份有限公司）；超純水（實驗室自制，Milli-Q純水系統(tǒng)）。

1.3動物SD大鼠，雌性，體質(zhì)量200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。動物實驗倫理審批號：TJABTJU20140003。

2　方法

2.1甘草素溶液配制取甘草素適量，精密稱定，溶于聚乙二醇400-生理鹽水（4∶6，v/v）溶液，制成每毫升含5 mg的甘草素溶液［5］。

2.2生物樣品采集

2.2.1血漿采集取健康SD大鼠6只，隨機(jī)分為2組，每組3只，給藥前禁食12h，分別iv、ig（20 mg/kg）給藥，肝素抗凝，目眥取血。iv組：2、5、10、15、30、45、60、120、240、360、480、600 min；ig組：15、30、60、90、120、240、360、480、600、720 min，-80℃保存。樣品處理前，等量混合各時間點血漿［6］，備用。

2.2.2尿液、糞便、膽汁采集另取6只健康SD大鼠，隨機(jī)分為2組，每組3只，置于代謝籠中，分別iv、ig（20 mg/kg）給藥，收集給藥前、給藥后0～24 h尿液、糞便，-80℃保存。大鼠飼養(yǎng)3 d后采集膽汁，給藥前禁食12 h，分別iv、ig（20 mg/kg）給藥，大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉，插管引流膽汁，收集0～24 h膽汁，-80℃保存。

2.3生物樣品處理

2.3.1血漿樣品處理取血漿1.2 mL，加甲酸酸化后（終濃度1%），加入3倍量甲醇，渦旋，14 000 r/min離心10 min。取上清液3.6 mL離心濃縮，加入200 μL 30%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋，14 000 r/min離心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀釋5倍，即得。

2.3.2尿液樣品處理取尿液3.5 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，加甲酸酸化（終濃度1%），D101大孔吸附樹脂純化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脫［7-8］，收集95%乙醇洗脫液，濃縮，加入200 μL 10%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋，14 000 r/min離心10 min。取上清液，用10%甲醇水溶液稀釋100倍，即得。

2.3.3糞便樣品處理取糞便1 g，精密稱定，碾碎，加入10倍量50%甲醇水溶液，超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min。取上清液9 mL，減壓濃縮，10 mL蒸餾水復(fù)溶，加甲酸酸化（終濃度1%），D101大孔吸附樹脂純化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脫。收集95%乙醇洗脫液，濃縮，加入200 μL 30%甲醇復(fù)溶，渦旋混勻，14 000 r/min離心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀釋200倍，即得。

2.3.4膽汁樣品處理取適量膽汁樣品，4 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，用0.1%甲酸水溶液稀釋1倍后加甲酸酸化（終濃度1%），D101大孔吸附樹脂純化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，濃縮，加入200 μL 30%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋，14 000 r/min離心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀釋1 000倍，即得。

2.4分析方法的建立

2.4.1色譜條件色譜柱：ACQUIFY UPLC BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～35%B；10～15min，35%～95%B；15～17min，95%B；17～17.5 min，95%～5%B；17.5～20 min，5%B；流速：0.4 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2質(zhì)譜條件ESI電噴霧離子源，負(fù)離子檢測模式；毛細(xì)管電壓-2 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度400℃；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量800 L/h；碰撞能量10～60 V；掃描范圍m/z 100～1 200；數(shù)據(jù)采集模式：MSE；數(shù)據(jù)分析：質(zhì)量虧損過濾（MDF）。

3　結(jié)果

3.1大鼠血漿、尿液、糞便、膽汁樣品UPLC-QTOF/MS分析大鼠血漿、尿液、糞便、膽汁樣品經(jīng)UPLC色譜分離，采用MSE掃描模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，運用Metabolynx軟件檢索代謝產(chǎn)物。通過代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子、特征碎片離子推測代謝產(chǎn)物［9-10］。本實驗采用iv和ig給藥方式，經(jīng)分析在大鼠體內(nèi)共檢測到15個代謝產(chǎn)物。大鼠空白及給藥后血漿、尿液、糞便、膽汁樣品中代謝產(chǎn)物的負(fù)離子提取離子流色譜圖，如圖1所示。甘草素代謝產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1。

3.2大鼠體內(nèi)甘草素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析甘草素是甘草黃酮的代表性成分，在大鼠體內(nèi)發(fā)生廣泛代謝，其主要代謝途徑有：異構(gòu)化、甲基化、脫氫反應(yīng)、葡萄糖醛酸化、硫酸化。負(fù)離子模式下，甘草素及其代謝產(chǎn)物易發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生特征性的碎片離子［11-12］。以甘草素為例，甘草素準(zhǔn)分子離子為m/z 255.065 8，二級碎片離子m/z 135.008 7，119.050 2，其質(zhì)譜裂解方式如下所示：

根據(jù)不同代謝途徑，對大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

異構(gòu)化反應(yīng)（M13、M14）：相關(guān)文獻(xiàn)報道［13］：大鼠給藥甘草素、甘草苷后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成異甘草素和二氫異甘草素。代謝物M13的保留時間為9.95 min，準(zhǔn)分子離子m/z 257.081 4，二級碎片離子為m/z 151，與文獻(xiàn)報道的二氫異甘草素質(zhì)譜信息一致，推測M13可能為二氫異甘草素。代謝物M14保留時間為10.29 min，碎片離子與甘草素相同，推測M14可能為異甘草素。

甲基化反應(yīng)（M15）：代謝物M15的保留時間為10.94 min，準(zhǔn)分子離子m/z 269.081 5，M15的質(zhì)量數(shù)比（異）甘草素多14，推測可能發(fā)生甲基化反應(yīng)。根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測M15可能為異甘草素甲基化的代謝產(chǎn)物。結(jié)合碎片離子m/z135，可推測甲基取代位點為異甘草素B環(huán)4′位羥基。

圖1　大鼠空白及給藥后血漿、尿液、糞便、膽汁提取離子流色譜圖Fig.1　The extracted ion chromatogram of blank and administrated plasma，urine，feces and bile in rats

脫氫反應(yīng)（M6）：代謝物M6保留時間為6.87 min，準(zhǔn)分子離子m/z 253.050 9，推測M6可能為（異）甘草素脫去2H的代謝產(chǎn)物，碎片離子m/z 209、135、117，結(jié)合文獻(xiàn)報道［14］，推測M6的脫氫反應(yīng)可能發(fā)生在甘草素C環(huán)C2-C3。

葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)（M1、M2、M3、M7、M8）：代謝物M1的保留時間為3.24 min，準(zhǔn)分子離子m/z 607.128 8，質(zhì)量數(shù)比（異）甘草素多352，推測可能結(jié)合2個葡萄糖醛酸。碎片離子m/z 431、255、175、135、119，其中m/z 255、135、119與（異）甘草素的特征碎片離子相同，根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測M1可能為甘草素二葡萄糖醛酸結(jié)合物。代謝物M2的保留時間為4.95 min，準(zhǔn)分子離子m/z 431.0982，質(zhì)量數(shù)比（異）甘草素多176，碎片離子m/z 255、175、135、119，根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測M2可能為甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物。代謝物M3、M7、M8的一、二級質(zhì)譜信息與代謝物M2的一致，因此，可根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測代謝物M3可能為甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物，M7、M8可能為異甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物，具體信息見表1。

表1　甘草素代謝產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.1　The characterization of metabolites of liquiritigenin by mass spectrometry

硫酸結(jié)合反應(yīng)（M4、M5、M9、M10、M11、M12）：代謝物M4的保留時間為5.79 min，準(zhǔn)分子離子m/z 335.0224，質(zhì)量數(shù)比（異）甘草素多80，碎片離子m/z 255、135、119，根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測M4可能為甘草素硫酸結(jié)合物。代謝物M5、M10、M12的一、二級質(zhì)譜信息與代謝物M4的一致，因此，可根據(jù)甘草素與異甘草素的色譜保留行為，推測代謝物M5可能為甘草素硫酸結(jié)合物，M10、M12可能為異甘草素硫酸結(jié)合物。代謝物M9的保留時間為7.91 min，準(zhǔn)分子離子m/z 337.0781，碎片離子m/z 257、151與二氫異甘草素的碎片離子相同，推測M9可能為二氫異甘草素硫酸結(jié)合物。代謝物M11的一、二級質(zhì)譜信息與代謝物M9的一致，因此推測代謝物M11可能為二氫異甘草素硫酸結(jié)合物，具體信息見表1。

根據(jù)以上信息，推測甘草素代謝途徑如圖2所示。

4　討論

為了減少生物樣品中的基質(zhì)對質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響，在樣品分析前需進(jìn)行純化處理，如：尿液中含有大量的水分、無機(jī)鹽及含氮物質(zhì)，膽汁中含有大量的膽汁酸和無機(jī)鹽［15］，糞便中含有大量的食物殘渣，可采用大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，使用0.1%甲酸水溶液洗脫，對樣品進(jìn)行脫鹽、除雜處理；血漿中富含各種蛋白質(zhì)會嚴(yán)重干擾質(zhì)譜檢測結(jié)果，本研究采用甲醇沉淀蛋白法去除。此外，高分辨質(zhì)譜的準(zhǔn)確度與化合物的濃度息息相關(guān)，化合物的濃度過高或過低均會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差較大。因此，為了準(zhǔn)確分析各生物樣品中的代謝產(chǎn)物，本研究先將上述純化后樣品濃縮，再根據(jù)不同生物樣品中代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜儀中的信號強(qiáng)度，調(diào)整各樣品的濃度，以保證所有生物樣品中的代謝產(chǎn)物能被質(zhì)譜準(zhǔn)確檢測。

圖2　大鼠體內(nèi)甘草素可能代謝途徑Fig.2　The proposed metabolic pathway of liquiritigenin in rats

藥物進(jìn)入機(jī)體，經(jīng)機(jī)體處置，最終隨尿液、糞便、汗液、乳汁等排出體外。其中尿液和糞便是藥物的主要排泄形式，藥物通過Ⅰ相、Ⅱ相代謝，改變、增加藥物的極性，其中極性較大的化合物隨血液流經(jīng)腎臟，經(jīng)腎小球濾過，以主動或被動形式隨尿液排出體外；極性較小的化合物經(jīng)肝臟代謝和膽鹽一起排入腸道，最終以糞便的形式排出體外。本研究結(jié)果：大鼠血漿主要檢測到（異）甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物等；尿液檢測到（異）甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物、異甘草素等；糞便主要檢測到原型藥物、二氫異甘草素及少量的（異）甘草素硫酸結(jié)合物等；膽汁中主要為原型藥物及少量的甘草素葡萄糖醛酸結(jié)合物。由結(jié)果可知，不同生物樣品中藥物代謝產(chǎn)物類型差異較大，Ⅰ相代謝產(chǎn)物主要存在糞便中，Ⅱ相代謝產(chǎn)物主要存在于血漿、尿液中；此外，為系統(tǒng)研究藥物的代謝輪廓，闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，需同時研究藥物在血漿、尿液、膽汁和糞便中的代謝產(chǎn)物。

5　結(jié)論

甘草素體內(nèi)主要代謝部位是肝臟，甘草素經(jīng)腸粘膜吸收后，在肝藥酶的作用下發(fā)生Ⅰ相、Ⅱ相代謝反應(yīng)［16-17］。甘草素在大鼠體內(nèi)進(jìn)行廣泛代謝，主要發(fā)生了異構(gòu)化、甲基化、脫氫、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合反應(yīng)。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Characterization of metabolites of liquirtigenin in rats by UPLC-Q-TOF/MS

LI Yuan-yuan1，2，JIANG Zhen-zuo1，2，ZHANG Lei1，2，CHAI Xin1，2，WANG Yue-fei1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300457，China）

［Objective］To systemically study metabolites of liquirtigenin in rats，an UPLC-Q-TOF/MS method was developed.［Methods］UPLC-Q-TOF/MS method was employed to identify metabolites of liquirtigenin in plasma，urine，feces and bile samples from rats after iv and ig administration of liquirtigenin（20 mg/kg）.［Results］A total of 15 metabolites were characterized in those biological samples，including isoliquirtigenin，glucuronides and sulfates of（iso）liquirtigenin，davidigenin and its sulfates，methylated isoliquirtigenin，dehydrogenated liquirtigenin.The main metabolic pathways of liquirtigenin were isomerization，glucuronidation and sulfation，methylation，dehydrogenation.［Conclusion］The UPLC-Q-TOF/MS method established in this study is successfully applied to identify metabolites of liquirtigenin in rats.

liquirtigenin；metabolite；UPLC-Q-TOF/MS；isomerization；glucuronidation；sulfation

R284

A

1672-1519（2015）12-0757-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.14

國家自然科學(xué)基金資助項目（81202877）。

李元元（1988-），女，碩士在讀，主要研究方向中藥質(zhì)量控制。

王躍飛，E-mail:wangyuefei_2006@hotmail.com。

（2015-07-03）