尹雪雁，許涼涼，伊辛，吳晨悅，蔡程科

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

均勻與正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化水飛薊賓微粒制備工藝的比較研究*

尹雪雁，許涼涼，伊辛，吳晨悅，蔡程科

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

［目的］通過(guò)快速膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備粒徑均一可控的水飛薊賓微粒，對(duì)其制備工藝進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳制備條件，并對(duì)均勻設(shè)計(jì)法和正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行比較。［方法］以水飛薊賓微粒的平均粒徑D（0.5）及徑距為指標(biāo)，用均勻設(shè)計(jì)法和正交設(shè)計(jì)法對(duì)水相濃度、油水相體積比、過(guò)膜壓力及固化時(shí)間等影響因素進(jìn)行考察。［結(jié)果］確定制備工藝為水相濃度3%、油水相體積比1∶2、過(guò)膜壓力0.6 MPa、固化時(shí)間60 min。［結(jié)論］該制備工藝簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、可靠，所得水飛薊賓微粒粒徑均一，均勻設(shè)計(jì)在水飛薊賓微粒制備工藝篩選實(shí)驗(yàn)中具有很好的可行性。

水飛薊賓；膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法；微粒；均勻設(shè)計(jì)；正交設(shè)計(jì)

水飛薊賓由一分子黃杉素和一分子松柏醇耦合而成，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)被損傷肝細(xì)胞合成DNA和結(jié)構(gòu)蛋白以及抗纖維化等藥理活性［1-2］；同時(shí)，兼有抗炎、降血脂、抗腫瘤等新功效［3-4］，對(duì)急慢性肝炎、代謝中毒性肝損傷和肝硬化具有較好的療效［5］，是世界上公認(rèn)的肝損傷修復(fù)藥［1］。目前已有相關(guān)的藥物上市，如水飛薊賓膠囊、復(fù)方益肝靈等藥物［6］。然而，水飛薊賓的水溶性及脂溶性低，口服吸收差，有較大的首過(guò)效應(yīng)，且體內(nèi)的半衰期短，生物利用度低，不能達(dá)到預(yù)期的臨床效果，因此，本研究突破常規(guī)，采用膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備水飛薊賓微粒，設(shè)法增加水飛薊賓的溶解度及溶出度，以提高其生物利用度［7］。實(shí)驗(yàn)中將藥物水飛薊賓溶于有機(jī)溶劑中，聚乙烯醇（PVA）水溶液作為抗溶劑，制備水飛薊賓微粒。

本研究以水飛薊賓微粒的平均粒徑D（0.5）和徑距（span）為考察指標(biāo)，采用新膜材合金加工的0.5微米級(jí)的多級(jí)串聯(lián)膜管，沿用前期的膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備粒徑均一的水飛薊賓微粒，以均勻設(shè)計(jì)法和正交設(shè)計(jì)法［8-9］對(duì)水飛薊賓微粒的制備工藝進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳制備工藝；在前期研究的基礎(chǔ)上，考察更小膜孔徑的膜管及增加膜管級(jí)數(shù)對(duì)微粒粒徑的影響；以目前已普遍認(rèn)可的正交設(shè)計(jì)法為對(duì)照，對(duì)應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法的可行性進(jìn)行分析。

1　儀器與材料

KH-7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），JFC-1600真空離子濺射儀（日本JEOL公司），JEM-6700F冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司），馬爾文激光粒徑測(cè)試儀（Mastersizer 2000，英國(guó)馬爾文儀器有限公司），快速膜乳化器（中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所），不銹鋼膜乳化裝置（北京中醫(yī)藥大學(xué)）。

水飛薊賓（西安華萃生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20111101，純度＞99%），聚乙烯醇PVA1788（山西三維集團(tuán)股份有限公司），去離子水（北京中醫(yī)藥大學(xué)），氯化鈉（北京市化工廠），乙酸乙酯等。

2　水飛薊賓微粒制備工藝研究

2.1樣品制備前期處理在水飛薊賓微粒的制備前，需經(jīng)過(guò)含藥油相、水相的制備等前期處理，以油相濃度0.8%，水相濃度3%，油水相體積比1∶9，制備100 mL預(yù)乳液［10］為例制備樣品。

制備水相：精密稱量3 g聚乙烯醇（PVA1788），邊攪拌邊加入100 mL常溫去離子水，IKA磁力攪拌器進(jìn)行攪拌（轉(zhuǎn)速檔×4，溫度檔×3），攪拌30 min至無(wú)明顯顆粒，60℃水浴鍋保溫，真空抽濾，過(guò)膜，待用。

制備含藥油相：精密稱取水飛薊賓0.8 g于具塞錐形瓶中，加入100 mL乙酸乙酯［11］有機(jī)溶劑，加塞封口，放入60℃水浴鍋中溶解至透明澄清，無(wú)明顯顆粒，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，待用。

2.2快速膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備水飛薊賓微粒精密稱取10 mL含藥油相，分散于90 mL水相中，不加成球輔料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），振蕩至均勻混懸，倒入快速膜乳化器［12］中，經(jīng)氮?dú)饧訅?，從出液口收集濾液，過(guò)膜3次，加入1倍量3%PVA溶液作固化液，磁力攪拌，固化1.5h，離心清洗4次（PVA基本被清除），生理鹽水復(fù)溶后，收集沉淀物，冷凍干燥制成凍干粉。

2.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3.1微粒的粒徑將一定量的凍干微粒在一定量的生理鹽水中分散，采用馬爾文激光粒徑測(cè)試儀測(cè)定粒徑分布。本實(shí)驗(yàn)采用平均粒徑D（0.5）值為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，D（0.5）越小粒徑越?。?3-14］。

③對(duì)試驗(yàn)路段進(jìn)行試鋪，確定攤鋪機(jī)的攤鋪速度、攤鋪寬度、攤鋪溫度、自動(dòng)找平方式等攤鋪步驟；壓路機(jī)碾壓溫度、碾壓速度、碾壓次數(shù)等壓實(shí)步驟以及松鋪系數(shù)。

2.3.2微粒的徑距同樣使用馬爾文粒徑測(cè)試儀可以檢測(cè)出微粒的徑距（span）。徑距代表微粒粒徑的跨越范圍，span值越小說(shuō)明微粒分布越均一。平均粒徑及徑距可由下圖1得出。

圖1　水飛薊賓微粒粒徑分布圖Fig.1　The distribution diagram of silybin particles size

2.3.3微粒的電鏡特征導(dǎo)電膠布粘在樣品臺(tái)上，取少量水飛薊賓微粒均勻平鋪于導(dǎo)電膠布上，并用吸耳球吹走多余粉末，抽真空，采用離子濺射儀對(duì)樣品噴金（20 mA，120 s）后，將樣品臺(tái)置于掃描電鏡樣品室中，抽真空，觀察微粒形貌［13-14］。圖2中（1）和（2）分別為微粒放大5 000倍和10 000倍下微粒的電鏡圖。

圖2　水飛薊賓微粒掃描電鏡圖Fig.2　The scanning electron microscope figure of silybin particles

3　水飛薊賓微粒常規(guī)制備的工藝參數(shù)

快速膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備水飛薊賓微粒的步驟主要包括預(yù)乳液的制備、乳液加壓過(guò)膜、溶劑揮發(fā)、固化清洗、微粒收集、冷凍干燥等環(huán)節(jié)，整個(gè)制備過(guò)程中存在很多影響微粒表征的因素。前期課題組已對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中膜管孔徑大小、油相濃度、水相濃度、油水相體積比、過(guò)膜壓力、預(yù)乳液與固化PVA溶液體積比［15-17］，以D（0.5）、span為指標(biāo)進(jìn)行了初步考察。常規(guī)因素水平：水相濃度、油相濃度、油水相體積比、固化液種類、過(guò)膜壓力、膜孔徑等，詳細(xì)說(shuō)明見(jiàn)表1。

表1　常規(guī)因素水平表Tab.1　Factors of the conventional level table

4　均勻設(shè)計(jì)法及正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化水飛薊賓微粒制備工藝的比較

4.1均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)合課題組前期單因素考察結(jié)果，篩選出對(duì)微粒制備影響較大的因素，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。以D（0.5）及span綜合的校正參數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，校正參數(shù)愈小，結(jié)果愈好。根據(jù)U9（95）（D=0.406 6）的均勻設(shè)計(jì)使用表，將水相濃度、油水比、過(guò)膜壓力、固化時(shí)間分別安排在表的1、2、3、5列（D=0.406 6），均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)水相濃度、油水相體積比、過(guò)膜壓力及固化時(shí)間各因素水平詳見(jiàn)表2，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案安排及結(jié)果詳見(jiàn)表3（n=2）。

均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性由SPSS17.0分析所得，分析結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表2　因素水平表Tab.2　Factor level table

表3　均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.3　Scheme and results of uniform design

表4　均勻設(shè)計(jì)相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果（n=18）Tab.4　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

由表4 SPSS17.0相關(guān)性分析結(jié)果可知，校正參數(shù)與油水比、過(guò)膜壓力兩因素的顯著性系數(shù)（P值）分別為0.020、0.000，兩者均小于0.05，說(shuō)明校正參數(shù)與油水比、過(guò)膜壓力兩因素相關(guān)；油水比、過(guò)膜壓力兩因素的Spearman相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值分別為0.489、0.867，說(shuō)明過(guò)膜壓力與校正參數(shù)的相關(guān)性較好，且油水比、過(guò)膜壓力兩因素與校正參數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。綜上，均勻設(shè)計(jì)工藝優(yōu)化的結(jié)果是油水比2∶3，壓力0.75 MPa。

4.2正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)同4.1均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)考察因素一致，通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。以D（0.5）及span兩者綜合的校正參數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，校正參數(shù)數(shù)值愈小愈好。根據(jù)L9（34）的正交表，將上述四因素分別安排在表的1、2、3、4列，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平安排詳見(jiàn)表5，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果詳見(jiàn)表6（n=2）。

4.2.1結(jié)果分析

表5　因素水平表Tab.5　Factor level table

表6　正交設(shè)計(jì)表Tab.6　Orthogonal design table

表7　正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果Tab.7　The results of orthogonal design-direct analysis

通過(guò)直觀分析可得出影響微粒的因素由大到小為：過(guò)膜壓力（C）＞水相濃度（A）＞油水比（B）＞固化時(shí)間（D），最佳實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)為C2A0B2D2。

4.2.1.2方差及相關(guān)性分析根據(jù)表6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，具體結(jié)果詳見(jiàn)表8。

由表8方差分析結(jié)果知，因素A、B、C、D的P值均小于0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明因素A、B、C、D對(duì)微粒的表征均有影響。結(jié)合表9相關(guān)性分析結(jié)果可知，因素A、C的P值分別為0.021、0.001，兩者均小于0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明因素A、C相對(duì)地與微粒表征的相關(guān)性較大；因素A、C的Spearman相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值分別為0.485、0.682，說(shuō)明因素C較因素A與微粒的相關(guān)性較大，最佳實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)為C2A0。結(jié)合實(shí)際條件，由表10過(guò)膜壓力與固化時(shí)間均值表可知，因素C在1、2水平C1、C2時(shí)均值相當(dāng)，為節(jié)省氮?dú)赓Y源，優(yōu)先考慮使用過(guò)膜壓力0.6MPa；因素D在0、2水平C0、C2時(shí)均值相當(dāng)，為提高制備效率，優(yōu)先考慮使用固化時(shí)間60 min，綜上，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的最佳工藝參數(shù)條件為C1A0B2D0，即水相濃度為3%，油水比為1∶2，過(guò)膜壓力為0.6 MPa，固化時(shí)間為60 min。

表8　正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.8　The results of analysis of variance

表9　正交設(shè)計(jì)相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果（n=18）Tab.9　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

表10　過(guò)膜壓力與固化時(shí)間均值Tab.1　0Mean of pressure through membrane and curing time

5　討論

快速膜乳化耦合溶劑揮發(fā)法制備水飛薊賓微粒的基本原理是把研究藥物溶解于有機(jī)溶劑中形成溶液，選擇另一種不能溶解藥物及有機(jī)溶劑的溶液作為抗溶劑，通過(guò)超聲或振蕩等方法將有機(jī)溶劑擴(kuò)散到抗溶劑中，形成乳液，乳液經(jīng)加壓通過(guò)多孔過(guò)濾膜管，有機(jī)溶劑被擠壓成微小液滴，分散在抗溶劑中，隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)，藥物微粒析出并懸浮于抗溶劑中，離心洗滌，收集微粒，即得水飛薊賓微粒?？焖倌と榛ㄖ苽涔に嚭?jiǎn)單、無(wú)需加熱、成本低，制得的微粒粒徑較小且均勻，本實(shí)驗(yàn)為水飛薊賓的合理研究開(kāi)發(fā)和有效利用提供了新的研究思路，提升了水飛薊賓的應(yīng)用價(jià)值。

由課題組前期的單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果可知，隨著過(guò)膜壓力增加，微粒D（0.5）及span呈減小的趨勢(shì)。均勻設(shè)計(jì)結(jié)果也表明，過(guò)膜壓力最大值0.75 MPa為優(yōu)化條件，與單因素考察結(jié)果相符。分析過(guò)膜壓力對(duì)微粒的影響受液滴黏度、液滴表面張力、膜管孔徑大小及堵塞程度等眾多因素影響。均勻設(shè)計(jì)中膜管清洗充分，乳液用量較少，但多級(jí)小孔徑新膜管的串聯(lián)使乳液過(guò)膜的分級(jí)壓力逐級(jí)遞減，較大的外界壓力才能使乳液順暢流出。將均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析比較后可知：在理論最佳制備條件方面，對(duì)過(guò)膜壓力和油水相體積比的結(jié)論是一致的，但考慮到實(shí)際制備條件，并且為了節(jié)省氮?dú)赓Y源，提高制備效率，對(duì)于新合金多級(jí)膜管的水飛薊賓微粒的制備，優(yōu)選過(guò)膜壓力0.6 MPa，油水相體積比1:2，水相濃度3%，固化時(shí)間60 min。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Comparative study on optimization of silybin particles preparation by uniform design and orthogonal design

YIN Xue-yan，XV Liang-liang，YI Xin，WU Chen-yue，CAI Cheng-ke
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

［Objective］To prepare silybin micro-particles by premix membrane emulsification coupling solvent evaporation，investigate its preparation procedure，optimize the preparation conditions by the uniform design and orthogonal design，respectively，and compare the two experiment design methods in terms of their feasibility.［Methods］With the average diameter of particle D（0.5）and span as criteria，the uniform design and orthogonal design were used，respectively，to examine the influence of such factors，as the aqueous phase concentration，volume ratio of oil phase to water，pressure through membrane and curing time，on the preparation procedure.［Results］It was found that the optimized preparation procedure was the aqueous phase concentration 3%，volume ratio of oil phase to water 1:2，pressure through membrane 0.6 MPa and the curing time for 60 min.［Conclusion］The preparation procedure is simple，fast，stable and reliable. The average diameter of particle of the silybin micro-particles is uniform.The uniform design shows a higher feasibility in the present screening test on the preparation procedure of the silybin micro-particles.

silybin；premix membrane emulsification coupling solvent evaporation；micro-particle；uniform design；orthogonal design

R283

A

1672-1519（2015）12-0752-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173562）。

尹雪雁（1989-），女，碩士在讀，從事中藥新劑型與新制劑研究。

蔡程科，E-mail:cck98@126.com。

（2015-06-29）