于芷晗，徐志強(qiáng)，趙雪峰

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

咪喹莫特抑制小鼠體表黑色素瘤生長(zhǎng)和促使腫瘤特異性放療增敏的實(shí)驗(yàn)研究

于芷晗，徐志強(qiáng)，趙雪峰

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

目的研究咪喹莫特聯(lián)合外放療對(duì)C57BL/6小鼠黑色素瘤模型腫瘤生長(zhǎng)的影響，并判定咪喹莫特對(duì)腫瘤特異性放療增敏的療效。方法建立C57BL/6小鼠(n=20)的體表黑色素瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、放療組、咪喹莫特治療組和放療聯(lián)合咪喹莫特治療組。測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)體積，觀察腫瘤生長(zhǎng)延遲效應(yīng)，并采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)和生存曲線評(píng)估咪喹莫特對(duì)腫瘤放療增敏效果。結(jié)果放療聯(lián)合咪喹莫特治療組腫瘤生長(zhǎng)延遲最顯著，其次治療效果依次為咪喹莫特治療組、放療組和對(duì)照組。4組間兩兩比較，差異均有顯著性意義(P<0.01)。C57BL/6小鼠黑色素瘤的組織病理學(xué)檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(MAP1LC3B)和α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)在放療聯(lián)合咪喹莫特治療組呈高表達(dá)。3種不同治療組的MAP1LC3B和α-SMA表達(dá)與對(duì)照組間比較，差異均有顯著性意義 (P<0.05)。C57BL/6小鼠生存表證實(shí)，放療聯(lián)合咪喹莫特治療組生存率明顯優(yōu)于其他治療組和對(duì)照組，差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論咪喹莫特聯(lián)合外放療對(duì)C57BL/6小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)有絕對(duì)延遲效應(yīng)，咪喹莫特可為新的腫瘤特異性放療增敏誘導(dǎo)劑。

咪喹莫特；黑色素瘤模型；放療增敏；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B；α-平滑肌激動(dòng)蛋白

[引用本文]于芷晗，徐志強(qiáng)，趙雪峰. 咪喹莫特抑制小鼠體表黑色素瘤生長(zhǎng)和促使腫瘤特異性放療增敏的實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(2)：119-123.

雖然體表黑色素瘤(localized melanoma)的外科治療越來越受青睞，但放療的有效性已毋庸置疑。因此，腫瘤放療增敏逐漸成為研究與討論的焦點(diǎn)。目前，對(duì)于無法手術(shù)切除或手術(shù)無法根治的中晚期黑色素瘤的治療方案相對(duì)有限。因此，對(duì)于黑色素瘤的新型治療，譬如放射免疫療法等新治療手段的開發(fā)和應(yīng)用尤為緊迫[1]。

咪喹莫特(imiquimod,IMQ)為非核苷雜環(huán)胺小分子免疫調(diào)節(jié)劑，作為Tool樣受體7/9(toll-like receptor 7/9,TLR7/9)顯效劑，透過誘導(dǎo)受體產(chǎn)生α干擾素(interferon α,IFNα)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)、白介素(interleukin,IL)等細(xì)胞因子，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤，并最終消除相關(guān)病損。在皮膚惡性黑色素瘤小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，IMQ乳膏經(jīng)皮給藥與瘤內(nèi)注入樹突狀細(xì)胞聯(lián)合治療皮膚惡性黑色素瘤可取得較好的效果[2]。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associate protein 1 chain 3B,MAP1LC3B)是哺乳動(dòng)物中酵母自噬相關(guān)蛋白8(autophagy-related protein 8)的同源體，自噬發(fā)生時(shí)可被招募至自噬體膜上，成為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白，被認(rèn)為是比較特異的自噬診斷指標(biāo)[3]。α-平滑肌激動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor-associated fibroblasts,TAFs)的特征性標(biāo)志物，不同部位腫瘤來源的TAFs促進(jìn)或抑制腫瘤生成的誘導(dǎo)作用有所不同[4]。在消滅腫瘤理念為基礎(chǔ)的分析過程中，減少腫瘤細(xì)胞和增殖及抑制腫瘤內(nèi)血管過度生長(zhǎng)無疑是治療腫瘤的有效方法。

本研究旨在探討IMQ聯(lián)合放療的可行性和安全性，并進(jìn)一步觀察IMQ對(duì)腫瘤放療增敏療效，為臨床實(shí)用奠定理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

B16F10黑色素瘤細(xì)胞株(TLR7+/TLR9+;ATCC)、咪喹莫特(IMQ) 及抗體均由韓國(guó)CNU腫瘤研究所Young-Kyu Park教授捐贈(zèng)。C57BL/6小鼠20 只，7周齡雌性，體重18～20 g，由韓國(guó)CNU實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及懸液制備:B16F10黑色素瘤細(xì)胞株在攝氏37 ℃、5% CO2，含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化液消化后，1000 r/min離心3 min，棄上清液，加無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL。制備好的細(xì)胞懸液冰浴保存，于30 min 內(nèi)進(jìn)行接種。

1.2.2黑色素瘤模型的建立:根據(jù)麻醉預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇異氟醚進(jìn)行全身麻醉。以小鼠右側(cè)后腋窩為中心剃除毛發(fā)，酒精棉球消毒后，左手用尖鑷提起其中央皮膚，右手用31號(hào)針頭注射器在其提起皮膚下方0.3 cm處緩慢注入B16F10黑色素瘤細(xì)胞懸液1×107/ 200 μL，見皮下球囊狀鼓起，放松尖鑷并拔針，用無菌棉球輕輕按壓穿刺處10 s。建立模型全程應(yīng)防止蘇醒，同時(shí)也要防止注入部位腫瘤細(xì)胞懸液的滲漏。

1.2.3動(dòng)物模型設(shè)計(jì):制模前1周為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穩(wěn)定期，防止進(jìn)行對(duì)C57BL/6小鼠的一切刺激性操作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共20只，建立模型的腫物平均直徑達(dá)10 mm后(約5～7天)，隨機(jī)分為對(duì)照組、放療組、咪喹莫特治療組和放療聯(lián)合咪喹莫特治療組，每組5只。每3 d作為1個(gè)治療單位，其中咪喹莫特治療組和放療聯(lián)合咪喹莫特治療組在每治療單位首日經(jīng)瘤內(nèi)注入IMQ(10 μg based on 0.5 mg/kg)，24 h后放療組和放療聯(lián)合咪喹莫特治療組再進(jìn)行外放療，第3日無任何處理。腫瘤外照射吸收劑量分別為第1個(gè)治療單位3 Gy、第2個(gè)治療單位3 Gy、第3個(gè)治療單位4 Gy。9 d的治療期后再觀察2周，實(shí)驗(yàn)共耗時(shí)約5周。見圖1。對(duì)照組未進(jìn)行任何處理。

1.2.4外放療具體方法:采用Varian 23-EX直線加速器進(jìn)行外照射：射線為6MV-X，源皮距離為80 cm，加1.5 cm的等效膜，腫瘤吸收總劑量為10 Gy；照射時(shí)間：給藥后24 h；照射前麻醉：5%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射。

1.2.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察指標(biāo):利用游標(biāo)卡尺每天測(cè)量腫瘤的最大直徑(a)和最小直徑(b)，按V=ab2/2公式計(jì)算腫瘤的體積，并記錄腫瘤生長(zhǎng)延遲效應(yīng)。C57BL/6小鼠出現(xiàn)頻死前癥狀或觀察期滿時(shí)予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔和胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。將體表腫瘤無潰瘍、壞死區(qū)域切取后，充分固定在4%多聚甲醛，行病理學(xué)檢查。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)及判斷指標(biāo):Polymer Kit(非生物素)二步法進(jìn)行檢測(cè)MAP1LC3B和α-SMA的表達(dá)。其中一抗工作濃度分別為1∶200和1∶1200，并以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)著色強(qiáng)度判斷陽性程度：標(biāo)本無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；其中2～3分為陽性表達(dá)。

圖1　動(dòng)物模型設(shè)計(jì)圖Fig 1 Animal model design

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間腫瘤生長(zhǎng)延遲效應(yīng)的比較采用雙因素方差分析來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間腫瘤放療增敏療效的比較采用χ2檢驗(yàn)和life tables過程，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1C57BL/6小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)延遲效應(yīng)

4組C57BL/6小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)體積檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，放療聯(lián)合咪喹莫特治療組腫瘤生長(zhǎng)延遲最顯著，其次治療效果依次為咪喹莫特治療組、放療組和對(duì)照組，4組組間差異均有顯著性意義 (P<0.01)(圖2)。檢測(cè)自第16天起咪喹莫特治療組腫瘤生長(zhǎng)體積迅速增大，并失去了控制腫瘤生長(zhǎng)的意義。

圖2　腫瘤生長(zhǎng)延遲效應(yīng)Fig 2 The delay of tumor growth

2.2MAP1LC3B和α-SMA蛋白質(zhì)在C57BL/6小鼠黑色素瘤組織中的表達(dá)

C57BL/6小鼠黑色素瘤組織的免疫組織化學(xué)檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)MAP1LC3B和α-SMA蛋白質(zhì)在放療聯(lián)合咪喹莫特治療組均高表達(dá)，其表達(dá)與其他治療組和對(duì)照組相比差異均有顯著性意義，各治療組與對(duì)照組比較，差異也均有顯著性意義(P均<0.05)，見表1，圖3。

圖3　MAP1LC3B和α-SMA免疫組織化學(xué)檢測(cè)　(×20)Fig 3 Representative images of MAP1LC3B and α-SMA immunohistochemical staining in melanoma tissues

2.3C57BL/6小鼠的生存率

自治療起點(diǎn)C57BL/6小鼠共觀察3周，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在觀察至18天全部死亡，但放療聯(lián)合咪喹莫特治療組全部生存。處死后對(duì)組織或器官進(jìn)行解剖分析，其結(jié)果除浸潤(rùn)到周圍肌肉組織外，以肝臟和肺臟轉(zhuǎn)移為主。經(jīng)C57BL/6小鼠生存表證實(shí)，放療聯(lián)合咪喹莫特治療組生存率明顯優(yōu)于其他治療組和對(duì)照組，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖4。

表1　黑色素瘤組織的免疫組織化學(xué)檢測(cè)Tab 1 Immunohistochemistries of melanoma tissues

A和E：對(duì)照組MAP1LC3B和α-SMA為低表達(dá)；B和F：RT組MAP1LC3B和α-SMA表達(dá)為中等；C和G：IMQ組MAP1LC3B和α-SMA表達(dá)為中等；D和H：RT+IMQ組MAP1LC3B和α-SMA為高表達(dá)

圖4　轉(zhuǎn)移器官和生存分析Fig 4 Metastatic organ and survival

3　討　論

黑色素瘤是較早應(yīng)用放療的惡性腫瘤之一。隨著抗感染及麻醉技術(shù)的進(jìn)步，黑色素瘤的手術(shù)治療越來越占主導(dǎo)，放療地位則日漸衰頹。近年來，隨著對(duì)黑色素瘤基礎(chǔ)與臨床研究的不斷進(jìn)展，放療的有效性慢慢升溫，而劑量分割和放療增敏逐漸成為學(xué)者們研究與討論的熱點(diǎn)[5]。經(jīng)過黑色素瘤的根治性放療后初始完全緩解率和腫瘤局部控制率很高，但無法有效遏制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且5年總生存率和無進(jìn)展生存率仍處于較低水平[6]。近年來，Zhang等[7]對(duì)放療增敏的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，HtrA2基因聯(lián)合放療可抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并能促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

IMQ是一種小分子IFN誘導(dǎo)新型免疫調(diào)節(jié)劑，是TLR7/9特異性配體，主要由巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞所識(shí)別。IMQ和這些細(xì)胞表面的TLR7/9特異性結(jié)合后誘導(dǎo)IFNα和IL12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以維持機(jī)體免疫功能的平衡[8]。IMQ乳膏經(jīng)皮給藥還是IMQ瘤內(nèi)直接注射有效，目前還沒有相關(guān)的解釋和報(bào)道，由于IMQ乳膏廣泛應(yīng)用于皮膚性疾病，而IMQ注射劑廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤，兩者均作用于相對(duì)特異性疾患。在冷凍手術(shù)并聯(lián)合IMQ治療黑色素瘤小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)小鼠的IFNα誘導(dǎo)和T細(xì)胞免疫反應(yīng)均有增強(qiáng)，從而增加了自身免疫的抗腫瘤能力，也為臨床治療黑色素瘤提供了免疫學(xué)方面的依據(jù)[9]。

目前認(rèn)為細(xì)胞死亡分為壞死、凋亡以及自噬。隨著生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，認(rèn)識(shí)到自噬性細(xì)胞死亡是不依賴于Caspase途徑的程序性細(xì)胞死亡，它不同于凋亡(I型程序性細(xì)胞死亡)，稱為II型程序性細(xì)胞死亡?，F(xiàn)一般認(rèn)為自噬一旦被過分激活就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的“自殺”行為。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著促進(jìn)和抑制雙重作用，可能是多種環(huán)境以及特有的基因特征和信號(hào)傳導(dǎo)途徑共同影響著自噬的活性和結(jié)果[10]。MAP1LC3B的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)，使之成為自噬體的標(biāo)志分子[11]。在實(shí)體腫瘤中，因腫瘤生長(zhǎng)速度迅猛導(dǎo)致腫瘤血液供應(yīng)不足，使瘤組織分為血液供應(yīng)充足的富氧細(xì)胞層、血液供應(yīng)不足的乏氧細(xì)胞層和得不到血液供應(yīng)的壞死細(xì)胞層。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，幾乎全部實(shí)體瘤均有乏氧細(xì)胞存在，約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的一半[12]。TAFs是腫瘤微環(huán)境的主要成分，在腫瘤-間質(zhì)相互作用以及血管生成等過程中起著重要作用，并不同部位腫瘤來源的TAFs促使或抑制腫瘤生成的誘導(dǎo)作用有所不同[13]。α-SMA是TAFs的特征性標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，放療聯(lián)合咪喹莫特治療組腫瘤生長(zhǎng)延遲最顯著，其次為咪喹莫特治療組和放療組。表明放療聯(lián)合咪喹莫特治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的延遲效應(yīng)。在IMQ對(duì)腫瘤放療增敏療效觀察中，發(fā)現(xiàn)MAP1LC3B和α-SMA在放療聯(lián)合咪喹莫特治療組均為高表達(dá)，同時(shí)放療聯(lián)合咪喹莫特治療組的生存率明顯優(yōu)于其他組，且無一例死亡。說明IMQ對(duì)腫瘤放療有明顯的增敏作用。值得反思的是，在檢測(cè)自第16天起咪喹莫特治療組的腫瘤生長(zhǎng)體積迅速增大，證明IMQ單藥無法控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。也就是說，C57BL/6小鼠黑色素瘤體積約達(dá)3000 mm3(非早期)時(shí)，IMQ單藥無法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自滅，反而叛逆腫瘤細(xì)胞的凋亡而迅速生長(zhǎng)。單純放療組雖沒出現(xiàn)如同IMQ單藥的應(yīng)用效果，但依然存在直線上升趨勢(shì)。放療聯(lián)合咪喹莫特治療組始終比較恒定的干擾著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖等過程。這意味著IMQ單藥加上放療是抑制腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展的良好組合。

綜上所述，C57BL/6小鼠黑色素瘤模型實(shí)施的IMQ聯(lián)合放療方案可行、安全。IMQ聯(lián)合外放療對(duì)C57BL/6小鼠黑色素瘤的生長(zhǎng)有絕對(duì)延遲效應(yīng)，同時(shí)IMQ值得稱之為新的腫瘤特異性放療增敏誘導(dǎo)劑。建議進(jìn)行亞臨床試驗(yàn)研究。

特此感謝韓國(guó)Young Kyu Park教授的捐贈(zèng)。

[1] Zheng SG,Xu HX,Guo LH,et al. The safety and treatment response of combination therapy of radioimmunotherapy and radiofrequency ablation for solid tumor:a study in vivo [J].PLoS One,2014,9(5):e96539.

[2] Lee JR,Shin JH,Park JH,et al. Combined treatment with intratumoral injection of dendritic cells and topical application of imiquimod for murine melanoma [J].Clin Exp Dermatol,2007,32(5):541-549.

[3] Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,et al. LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing [J].EMBO J,2000,19(21):5720-5728.

[4] Tsai HE,Liu GS,Kung ML,et al. Downregulation of hepatoma-derived growth factor contributes to retarded lung metastasis via inhibition of epithelial-mesenchymal transition by systemic POMC gene delivery in melanoma [J].Mol Cancer Ther,2013,12(6):1016-1025.

[6] Burmeister BH,Henderson MA,Ainslie J,et al. Adjuvant radiotherapy versus observation alone for patients at risk of lymph-node field relapse after therapeutic lymphadenectomy for melanoma:a randomised trial [J].Lancet Oncol,2012,13(6):589-597.

[7] Zhang F,Yu T,Yi CL,et al. Radiation-inducible HtrA2 gene enhances radiosensitivity of uveal melanoma OCM-1 cells in vitro and in vivo [J].Clin Experiment Ophthalmol,2014,42(8):761-768.

[8] Camateros P,Kanagaratham C,Henri J,et al. Modulation of the allergic asthma transcriptome following resiquimod treatment [J].Physiol Genomics,2009,38(3):303-318.

[9] Redondo P,del Olmo J,López-Diaz de Cerio A,et al. Imiquimod enhances the systemic immunity attained by local cryosurgery destruction of melanoma lesions [J].J Invest Dermatol,2007,127(7):1673-1680.

[10] Yorimitsu T,Nair U,Yang Z,et al. Endoplasmic reticulum stress triggers autophagy [J].J Biol Chem,2006,281(40):30299-30304.

[11] Kuma A,Matsui M,Mizushima N. LC3,an autophagosome marker,can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy:caution in the interpretation of LC3 localization[J].Autophagy,2007,3(4):323-328.

[12] Siemann DW. 10th Int conferences on mondifiers of cancer treatment [M]. Clerawater Florida,USA,1998:28-31.

[13] Khalili JS,Liu S,Rodríguez-Cruz TG,et al. Oncogenic BRAF(V600E) promotes stromal cell-mediated immunosuppression via induction of interleukin-1 inmelanoma [J].Clin Cancer Res,2012,18(19):5329-5340.

Effects of imiquimod on the growth inhibition of B16F10 melanoma cells and induces tumor-specific radiosensitivity in C57BL/6 mice model

YU Zhi-han,XU Zhi-qiang,ZHAO Xue-feng

(DepartmentofGeneralSurgery,DalianUniversityAffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

Objective To investigate the tumor-specific radiosensitivity of B16F10 melanoma cells with imiquimod combines with or without irradiation,and to determine the effects on the tumor growth of localized melanoma model in C57BL/6 mice. Methods B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously into the right hind axilla of C57BL/6 mice by othotopic implantation to establish the localized melanoma model. The tumor-bearing C57BL/6 mice were randomized into 4 groups,control group,radiation group (RT group),intra-tumoral injection of imiquimod group (IMQ group),and RT combined with IMQ group (RT+IMQ group). When tumor volume was measuring longest and shortest diameter,the tumor growth curve was observed at various times after injection and/or irradiation in tumor-bearing C57BL/6 mice. The effect of treatment was assessed by tumor growth delay. The effects of tumor radiosensitivity were evaluated using anti-LC3B and α-SMA immunohistochemistry in melanoma tissues,and analyzed the C57BL/6 mice survival. Results The delay of tumor growth was highest in the group which received treatment of RT+IMQ,the second highest was the group which only received treatment of IMQ,the third is the group which only received treatment of RT,and the last is the group which received control (P<0.05). Expression of microtubule-associate protein 1 light chain 3B (MAP1LC3B) and alpha smooth muscle actin (α-SMA) protein was marked histopathological difference of C57BL/6 mice of localized melanoma tissues between RT+IMQ group and control group，and difference was statistically significant (P<0.05). Life tables showed that RT+IMQ group is inversely correlated with overall survival of C57BL/6 mice with localized melanoma model(P<0.05).

Conclusions These results suggest that imiquimod combined with irradiation would be promoted absolute tumor growth delay in C57BL/6 mice of localized melanoma model,and imiquimod may be a novel tumor-specific radioseccitivity of inducer for melanoma.

IMQ; melanoma model; radiosensitivity; MAP1LC3B; α-SMA

論著10.11724/jdmu.2015.02.04

于芷晗(1980-)，女，遼寧大連人，主治醫(yī)師。

趙雪峰，博士后，主治醫(yī)師。E-mail:zhaoxuefeng74@hanmail.net

R318.19

A

1671-7295(2015)02-0119-05

2014-12-01；

2015-03-06)