羅　旭，王　聰，范　寧，羅文超，徐　飛，李　巖

(1.鞍山市腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 鞍山 114034； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

S100A4在肺鱗癌與肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異和生物學(xué)作用

羅旭1，王聰2，范寧2，羅文超2，徐飛2，李巖2

(1.鞍山市腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 鞍山 114034； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

目的研究S100A4在肺鱗癌與肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲功能的影響。方法利用RT-PCR和Western Blot檢測S100A4在肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520和肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1中的表達(dá)，利用siRNA干擾S100A4在兩個細(xì)胞系的表達(dá)，CCK-8檢測細(xì)胞增殖，劃痕、Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移侵襲。結(jié)果RT-PCR與Western Blot檢測結(jié)果顯示S100A4在肺鱗癌及肺腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，且肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520中S100A4表達(dá)水平低于肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1(P<0.05)。細(xì)胞熒光、Western Blot 及RT-PCR驗證S100A4敲除效率，CCK-8實驗證明干擾S100A4后，兩肺癌細(xì)胞系的增殖能力較空白對照組和陰性對照組均降低(P<0.05)、劃痕及Tranwell實驗證明干擾S100A4后，兩肺癌細(xì)胞系的遷移能力與對照組相比也降低(P<0.05)。結(jié)論S100A4在肺鱗癌細(xì)胞系與肺腺癌細(xì)胞系均有表達(dá)，且鱗癌高于腺癌，S100A4與肺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展有關(guān)，有可能成為肺癌治療的新靶點。

肺鱗癌；肺腺癌；S100A4；siRNA

[引用本文]羅旭，王聰，范寧，等. S100A4在肺鱗癌與肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異和生物學(xué)作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,37(2)：109-113.

肺癌是中國發(fā)病率最高的腫瘤之一，居男性癌癥發(fā)病首位和女性癌癥發(fā)病第2位，而死亡率均是首位。組織學(xué)分型將肺癌分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和肉瘤樣癌等幾種基本類型。目前肺癌中常見的是腺癌和鱗狀細(xì)胞癌。肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。S100A4屬于S100家族的鈣結(jié)合蛋白，是由101個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為11.5 kD的小分子多肽[1]。S100A4參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡、細(xì)胞運動與黏附、細(xì)胞外基質(zhì)重建以及血管生成等過程，主要發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲的生物學(xué)效應(yīng)。本研究探討S100A4在肺鱗癌與肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其生物學(xué)功能，以期為基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化提供新的依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

人肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520來自大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，人肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1來自于同校病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Takara公司)，CCK-8試劑盒(DOJINDO公司)，兔抗人S100A4多克隆抗體(abgent公司)，HPP標(biāo)記兔二抗(Thermo公司)，Transwell小室、基質(zhì)膠(BD公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：NCI-H520培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，SPC-A-1培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基均含10%FBS和青霉素50 U/mL，鏈霉素50 mg/mL)置于37 ℃、含5%CO2孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2RT-PCR檢測：細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心收集，TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明擴(kuò)增，上游引物：5’-TCAGAACTAAAGGAG CTGCTGACC-3’，下游引物：5’-TTTCTTCCTGGGCTGCTTATCTGG-3’。反應(yīng)條件為 95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃ 10 min，以β-actin作為內(nèi)參，2%瓊脂糖跑膠，成像。

1.2.3Western Blot檢測：待測細(xì)胞加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min，4 ℃ 12000 g離心10 min，取上清；蛋白濃度定量后，將樣品調(diào)成相同濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min；進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，將膜與一抗4 ℃下孵育過夜，第2天再與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗在37 ℃下孵育，將膜與ECL發(fā)光底物接合，曝光、顯影、成像。目的條帶的光密度與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白β-actin條帶的光密度的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)值。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染：S100A4 小干擾RNA購自吉瑪公司，序列如下：

S100A4-KD1 CUGCUUUCCAGAAGCUGAUTT AUCAGCUUCUGGAAAGCAGTT

S100A4-KD2 GCAUCGCCAUGAUGUGUAATT UUACACAUCAUGGCGAUGCTT

S100A4-KD3 GCCAUGAUGUGUAACGAAUTT AUUCGUUACACAUCAUGGCTT

應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)入上述細(xì)胞系內(nèi)，具體方法參照lipofec-tamine 2000使用說明書，轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入2 mL無雙抗培養(yǎng)基與細(xì)胞混合培養(yǎng)；6 h后更換無雙抗培養(yǎng)基，24 h以后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步檢測。

1.2.5細(xì)胞增殖實驗：NCI-H520和SPC-A-1細(xì)胞系接種1000/孔于96孔培養(yǎng)板中。設(shè)為3組：未轉(zhuǎn)染組為空白對照組，轉(zhuǎn)染無效序列組為陰性對照組，和轉(zhuǎn)染S100A4干擾序列組。每組設(shè)3個副孔。轉(zhuǎn)染siRNA后24 h,48 h,72 h,96 h加入CCK-8 10 μL，孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后，酶標(biāo)儀檢測OD 450 nm處各孔的OD值。取平均值并繪制曲線圖(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.2.6劃痕實驗：細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后用槍頭在每個孔內(nèi)均勻劃線并加入無血清培養(yǎng)基；放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h拍照取圖。

1.2.7細(xì)胞侵襲實驗：基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1∶3比例混合，每孔50 μL，每孔接種1×105個轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，小室下層加入600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基。24 h后取出小室，用棉簽小心擦去小室內(nèi)基質(zhì)膜上層的細(xì)胞和基質(zhì)膠，下層細(xì)胞用4%甲醛固定30 min；結(jié)晶紫染色，鏡下觀察，照相。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，組間計數(shù)資料采用獨立樣本t檢驗以及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1S100A4在NCI-H520和SPC-A-1中的差異表達(dá)

利用RT-PCR和Western Blot在mRNA和蛋白層面分別檢測S100A4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在NCI-H520中的表達(dá)低于SPC-A-1，兩種檢測方法結(jié)果一致。見圖1。

2.2在肺鱗癌和肺腺癌中干擾S100A4對細(xì)胞增殖和凋亡的影響

應(yīng)用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑，在NIC-H520和SPC-A-1細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)，24 h后熒光顯微鏡觀察瞬時轉(zhuǎn)染效率，可見表達(dá)綠色熒光細(xì)胞約占NCI-H520細(xì)胞和SPC-A-1細(xì)胞的80%～90%(圖2A)。RT-PCR和Western Blot分別檢測敲低效率，轉(zhuǎn)染24 h后S100A4表達(dá)開始下降(圖2A)。利用CCK-8檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示兩組實驗組(siRNA-S100A4)細(xì)胞增殖率均明顯小于空白對照組(Blank)和陰性對照組(siRNA-NC)，細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.05)。見圖2B。

圖1　S100A4在肺鱗癌、腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)特點Fig 1 Expression of S100A4 in lung adenocarcinoma cell line SPC-A-1 and H520

圖2　在肺鱗癌、腺癌細(xì)胞系中分別干擾S100A4對細(xì)胞增殖影響Fig 2 Knock down S100A4 influenced the cell proliferation in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma cell lines

2.3干擾S100A4對肺鱗癌和肺腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

NCI-H520和SPC-A-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行劃痕實驗，分別于0 h、24 h、48 h分別觀察劃痕愈合情況，發(fā)現(xiàn)敲低S100A4后兩個細(xì)胞系的遷移能力均顯著降低(圖3)。Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)NIC-H520和SPC-A-1細(xì)胞系中實驗組(siRNA-S100A4)侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為(8±1)個和(58±7)個，空白對照組(Blank)分別為：(30±5)個和(160±11)個；而陰性對照組(siRNA-NC)分別為：(27±3)個和(155±13)個，干擾S100A4較空白對照組和陰性對照組細(xì)胞的侵襲性顯著下降(P<0.05)。見圖3。

圖3　在肺鱗癌、腺癌細(xì)胞系中分別干擾S100A4對細(xì)胞遷移能力的影響Fig 3 Knock down S100A4 influenced the cell migration in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma cell lines

3　討　論

肺癌是目前惡性度較高的腫瘤之一，中國肺癌死亡率已達(dá)60萬，居城鎮(zhèn)腫瘤死亡首位。肺鱗癌與肺腺癌約占肺癌的80%以上，早期肺癌患者主要選擇手術(shù)治療，但由于早期癥狀常不明顯易被忽略，因此許多患者確診時已錯過最佳治療時機(jī)。S100A4屬于S100家族的鈣結(jié)合蛋白[2]，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的運動和侵襲能力與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。S100A4基因又被稱為metastatin(MTS1)，成纖維細(xì)胞特異性蛋白(FSP1)，p9Ka，18A2，pEL98，42A，CAPL和calvasculin，是由101個氨基酸組成的、相對分子質(zhì)量為11.5 kD的小分子多肽[1]，通過參與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡、細(xì)胞運動與黏附、細(xì)胞外基質(zhì)重建以及血管生成等過程發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲的生物學(xué)效應(yīng)，S100A4在許多類型的癌癥中高表達(dá)，包括膀胱癌[3]，乳腺癌[4]，結(jié)直腸癌[5]，胃癌[6]，胰腺[7]和前列腺[8]等，且與癌癥的進(jìn)展以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

本課題組前期研究顯示，胃腺癌中S100A4在癌旁相對正常組織、癌前病變組織和胃癌組織中，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢[9]。S100A4在胃癌組織和細(xì)胞系中因去甲基化而表達(dá)上調(diào)。但在皮膚性上皮腫瘤中，S100A4表達(dá)特點相反，在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中因高甲基化而表達(dá)下調(diào)或沉默[10]。

本研究首先檢測了S100A4在肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520及肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1中的表達(dá)，結(jié)果顯示S100A4在肺腺癌中的表達(dá)比在肺鱗癌中的表達(dá)高，Chen XL等[11]在非小細(xì)胞肺癌組織的研究顯示S100A4在肺腺癌的表達(dá)率高于在肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。提示S100A4可能存在組織差異性表達(dá)的特性。

隨后本實驗利用RNA干擾(RNA interfering，RNAi)技術(shù)特異性沉默S100A4表達(dá)，并篩選了表達(dá)抑制效果最明顯的siRNA，確定表達(dá)抑制持續(xù)時間段，以便進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能實驗。隨后分別檢測敲低S100A4對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)沉默S100A4后兩個細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲都顯著減低，說明S100A4在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過程中起到一定的作用?？赡芘cS100A4螯合p53，使p53喪失其在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用及G1/S期的檢查點功能有關(guān)[12]，因此DNA已發(fā)生突變的細(xì)胞可以擺脫p53對G1/S期調(diào)控點的控制，順利的進(jìn)入S期，從而為細(xì)胞惡變提供了可能，抑制惡變細(xì)胞的凋亡。

腫瘤細(xì)胞間黏附的減弱是其侵襲轉(zhuǎn)移必不可少的條件。S100A4的表達(dá)與細(xì)胞黏附分子E-cadherin相關(guān)。而惡性腫瘤的進(jìn)展往往伴隨著E-cadherin的表達(dá)抑制[13]。除此之外，S100A4蛋白可與非骨骼肌肌球蛋白重鏈、原肌球蛋白、肌球蛋白-IIA[14-16]相互作用，通過細(xì)胞內(nèi)信號途徑誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)[17]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運動。由此可見S100A4在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究驗證了S100A4在肺鱗癌與肺腺癌中的表達(dá)差異，且對肺癌的增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生影響。本課題組將進(jìn)一步建立實驗動物模型，在體內(nèi)探究S100A4在腫瘤中的生物學(xué)功能，為探究S100A4在肺部腫瘤中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

[1] Matsumoto K,Irie A,Satoh TJ,et al. Expression of S100A2 and S100A4 predicts for disease progression and patient survival in bladder cancer [J].Urology,2007,70:602-607.

[2] Mitsudomi T,Kosaka T,Endoh HY,et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence [J].J Clin Oncol,2005,23:2513-2520.

[3] Hitoshi Sekine,Na Chen,Keisuke Sato,et al. S100A4,frequently overexpressed in various human cancers,accelerates cell motility in pancreatic cancer cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2012,429:214-219.

[4] Tsukamoto N,Egawa S,Akada MK,et al. The expression of S100A4 in human pancreatic cancer is associated with invasion [J].Pancreas,2013,42:1027-1033.

[5] Kimura K,Endo Y,Yonemura Y,et al. Clinical significance of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in non-small cell lung cancer [J].Int J Oncol,2000,16:1125-1131.

[6] Hua Zhang,Jun Liu,Dongsheng Yue,et al. Clinical significance of E-cadherin,β-catenin,vimentin and S100A4 expression in completely resected squamous cell lung carcinoma [J].J Clin Pathol,2013,66:937-945.

[7] Matsubara D,Niki T,Niki T,et al. Differential expression of S100A2 and S100A4 in lung adenocarcinomas:clinicopathological significance,relationship to p53 and identification of their target genes [J].Cancer Sci,2005,96:844-857.

[8] Kato C,Kojima T,Komaki M,et al. S100A4 inhibition by RNAi up-regulates osteoblast related genes in periodontal ligament cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,326:147-153.

[9] Li Y,Liu ZL,Zhang KL,et al. Methylation-associated silencing of S100A4 expression in human epidermal cancers [J].Exp Dermatol,2009,18(10):842-848.

[10] Chen NN,Li Y,Liu ZL,et al.CRABP-II-and FABP5-independent-all Transretinoic acid resistance in COLO 16 human cutaneous squamous cancer cells [J].Exp Dermatol,2012,21:13-18.

[11] Chen XL,Zhang WG,Chen XY,et al. Correlations of S100A4 protein expression to invasion and metastasis of non-small cell lung cancer [J].Chinese Journal of cancer,2006,25(9):1134-1137.

[12] Orre LM,Panizza E,Kaminskyy VO,et al. S100A4 interacts with p53 in the nucleus and promotes p53 degradation [J].Oncogene,2013,32(49):5531-5540.

[13] Ikoma N,Yamazaki H,Abe Y,et al. S100A4 expression with reduced E-cadherin expression predicts distant metastasis of human malignant melanoma cell lines in the NOD/SCID/gamma null (NOG) mouse model [J].Oncol Rep,2005,14(3):633-637.

[14] Zhang S,Wang G,Fernig DG,et al. Interaction of metastasis-inducing S100A4 protein in vivo by fluorescence lifetime imaging microscopy [J].Eur Biophys J,2005,34(1):19-27.

[15] Zhong-Hua Li,Anne R. Bresnick. The S100A4 metastasis factor regulates cellular motility via a direct interaction with myosin-IIA [J].Cancer Res,2006,66(10):5173-5180.

[16] Ismail TM,Fernig DG,Rudland PS,et al. The basic C-terminal amino acids of calcium-binding protein S100A4 promote metastasis [J].Carcinogenesis,2008,29(12):2259-2266.

[17] Laval S,Laklai H,Fanjul M,et al. Dual roles of hemidesmosomal proteins in the pancreatic epithelium:the phosphoinositide 3-kinase decides [J].Oncogene,2014,33(15):1934-1944.

Different expression of S100A4 in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma cells and biological functions

LUO Xu1,WANG Cong2,FAN Ning2,LUO Wen-chao1,XU Fei2,LI Yan2

(1.DepartmentofOncology，AnshanCancerHospital,Anshan114034,China; 2.CollegeofBasicMedicalSciences,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Objective To explore the expression of S100A4 in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma cells and its effection in proliferation,metastasis,invasion. Methods RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of S100A4 in lung squamous carcinoma NCI-H520 and adenocarcinoma SPC-A-1 cell lines,using siRNA to knockdown S100A4 in these two cell lines and CCK-8,wound healing assay and transwell experiment were used to detect the cell proliferation,migration and invasion. Results The expression of S100A4 was different in these two cell lines and the expression was lower in squamous carcinoma than adenocarcinoma (P<0.05). The transfection efficiency was detected by immunofluorescence,Western Blot and RT-PCR. Knocking down S100A4 significantly reduced the cell proliferation,migration which was confirmed by CCK-8,wound healing and transwell assay (P<0.05). Conclusion Expression of S100A4 in lung squamous carcinoma NCI-H520 was significantly lower than adenocarcinoma SPC-A-1 cell line. Knocking down S100A4 reduced the lung cancer cell malignant and may be a potential target for lung cancer treatment.

squamous carcinoma; adenocarcinoma; S100A4; siRNA

論著10.11724/jdmu.2015.02.02

國家自然科學(xué)基金項目(81102069)

羅 旭(1975-)，女，遼寧鞍山人，主任醫(yī)師。E-mail：lilei998@126.com

李 巖，教授。E-mail：ly316@126.com

R734.2

A

1671-7295(2015)02-0109-05

2014-12-01；

2015-03-06)