方紅娟，馮 瓊，王 強(qiáng)，張 強(qiáng)，史云湘，陳金龍*，鐘歷勇*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100050;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京100010)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是引發(fā)2型糖尿病的始發(fā)因素，其機(jī)制是預(yù)防和治療2型糖尿病的關(guān)鍵。IR是指骨骼肌、脂肪組織、肝臟等胰島素靶器官對(duì)胰島素的敏感性下降，進(jìn)而產(chǎn)生葡萄糖(glucose，GLU)的代謝能力障礙，是引起一些代謝性疾病的主要因素之一［1］。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是鞘磷脂代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，研究表明SPK1能夠降低2型糖尿病KK-Ay小鼠的血糖，改善胰島素抵抗［2］。高胰島素血癥對(duì)誘導(dǎo)胰島素抵抗起重要調(diào)節(jié)作用，肝臟胰島素抵抗可誘發(fā)高血糖［3］。SPK1催化產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是一個(gè)重要的活性脂質(zhì)分子，其對(duì)肝細(xì)胞IR糖代謝的研究目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察S1P對(duì)人肝細(xì)胞胰島素抵抗模型糖代謝的影響，以期為糖尿病的發(fā)病機(jī)制及藥物開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞株(LO2)(北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司);RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);牛胰島素、SPK1抗體、S1P和二氯熒光素探針(Sigma公司);油紅O染液(南京建成科技有限公司);線粒體標(biāo)記熒光探針(Molecular Probes公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及IR模型建立:LO2細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到80%匯合度的時(shí)候，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗貼壁細(xì)胞，除去培養(yǎng)瓶中殘留的血清，然后用0.25%胰蛋白酶消化，每5天傳代1次，每次按1∶3比例傳代。取對(duì)數(shù)期的LO2細(xì)胞，按照1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，每孔500 μL。待細(xì)胞貼壁增殖到80%左右匯合時(shí)，分別加入 10、50、100、500 和1 000 nmol/L的胰島素(insulin，INS)，然后在 12、24、36、48和60 h后更換新鮮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h后進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，隨機(jī)選取4個(gè)1 000 nmol/L INS誘導(dǎo)組，在以上實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)48 h后，分別加入0、0.5、1.0、5.0 μmol/L 的 S1P，繼續(xù)培養(yǎng) 10 和30 min后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力:將LO2細(xì)胞按103～104個(gè)細(xì)胞∕孔接種96孔板中，待細(xì)胞貼壁，長(zhǎng)滿80%左右，倒掉培養(yǎng)液，分別按 10、50、100、500 和1 000 nmol/L的濃度加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的INS，每孔200 μL，不加INS組為對(duì)照組，每組另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，即沒(méi)有細(xì)胞只加培養(yǎng)液，共8個(gè)平行對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4～6 h，倒掉上清，每孔加入DMSO溶液150 μL。在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔吸光度A490值。

1.2.3 葡萄糖-己糖激酶法檢測(cè)GLU含量:細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，取上清液，4℃、2 000 r/min離心1 min去沉淀，應(yīng)用多功能自動(dòng)生化儀葡萄糖-己糖激酶法檢測(cè)GLU含量。

1.2.4 油紅O染色鑒定細(xì)胞脂肪變性:用10%甲醛固定細(xì)胞30 min，油紅O染液按5∶2體積比稀釋?zhuān)瑸V紙過(guò)濾后，每孔緩慢加入3 mL染液，染色10 min后，倒掉染液，用去離子水漂洗細(xì)胞1 min左右，去除雜質(zhì)，然后用蘇木精染液染色10 s，倒去染液，用去離子水漂洗30 s。在倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.5 熒光染色檢測(cè)細(xì)胞ROS:培養(yǎng)板細(xì)胞用PBS沖洗3次，加入RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的二氯熒光探針5 μmol/L，線粒體標(biāo)記熒光探針 500 μmol/L，每孔1.5 mL，共同孵育40 min，倒掉上清液，再用PBS沖洗細(xì)胞3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，藍(lán)色熒光強(qiáng)度代表活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成情況，綠色熒光顯示的是細(xì)胞線粒體。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):提取各組細(xì)胞總蛋白，每孔加樣10 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，用300 mA電流濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，SPK1抗體按照1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，洗膜后，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，采用增強(qiáng)型發(fā)光液，暗室顯影曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度INS溶液對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響及培養(yǎng)液中殘存GLU濃度變化

不同濃度的INS對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響。不同濃度INS作用細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，50和500 nmol/L INS組培養(yǎng)液中GLU含量均顯著下降(*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01)，10、100 和 1 000 nmol/L INS組細(xì)胞的GLU吸收能力無(wú)顯著變化(表1)。

表1 不同濃度INS溶液對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞上清中GLU含量變化Table 1 Effects of different levels of insulin on cell proliferation and the glucose levels(x ± s，n=8)

2.2 INS刺激細(xì)胞不同時(shí)間后培養(yǎng)液殘存GLU濃度

1000nmol/L INS作用LO2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞吸收GLU的能力開(kāi)始增加(表2);36 h后，吸收GLU能力顯著增加(P＜0.01);在48 h后，GLU濃度開(kāi)始上升，細(xì)胞吸收GLU能力下降，與36 h相比有顯著性差異(P＜0.05);60 h后，細(xì)胞吸收GLU的能力比48 h顯著增加(P＜0.01)。對(duì)100 nmol/L INS組也做了不同時(shí)間GLU濃度檢測(cè)，結(jié)果均無(wú)顯著差異。

表2 1 000 nmol/L的INS溶液作用不同時(shí)間細(xì)胞上清中GLU含量Table 2 The glucose levels in different time after 1 000 nmol/L insulin induced(x ± s，n=6)

2.3 油紅O染色技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴產(chǎn)生量

油紅O能特異性使脂肪組織或細(xì)胞中的脂質(zhì)著色。圖1提示，油紅O染色后，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)紅色顆粒形狀，分布在細(xì)胞膜周?chē)Ｅc對(duì)照組相比，不同濃度的INS作用LO2細(xì)胞后，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴顏色加深，面積也有不同程度的增大。其中1 000 nmol/L的INS組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色部分的面積最大，顏色也最深。

2.4 模型組細(xì)胞總ROS和線粒體ROS變化

經(jīng)二氯熒光探針處理后，細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS呈現(xiàn)為綠色，圖2中可以看到IR模型組產(chǎn)生的ROS要比對(duì)照組明顯增多，模型組氧化損傷程度顯著高于對(duì)照組;經(jīng)線粒體紅色熒光探針處理后，細(xì)胞中的線粒體呈現(xiàn)為紅色。兩圖重疊以后，圖中的黃色部分即來(lái)自線粒體的ROS，可以觀察到模型組的線粒體ROS比對(duì)照組顯著增多。

2.5 不同濃度的INS誘導(dǎo)細(xì)胞后SPK1蛋白表達(dá)變化

用不同濃度的INS作用LO2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞SPK1蛋白表達(dá)量明顯增多;隨著INS濃度的增大，SPK1蛋白的表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)，其中1 000 nmol/L INS組的SPK1蛋白表達(dá)量最多(圖3)。

2.6 S1P對(duì)胰島素抵抗模型組細(xì)胞血糖吸收的影響

圖1 不同濃度INS素溶液作用LO2細(xì)胞48 h后油紅O染色結(jié)果Fig 1 The oil red O staining of LO2 cells after 48 hours induced by different levels of insulin(×200)

在模型組細(xì)胞中分別加入0、0.5、1.0和5.0 μmol/L S1P后，在10和30 min檢測(cè)培養(yǎng)液中GLU的濃度。隨著S1P濃度的增大，模型組細(xì)胞吸收GLU的能力呈遞增趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，0.5 μmol/L組細(xì)胞吸收GLU無(wú)顯著變化，1.0和5.0 μmol/L組細(xì)胞的吸收均有顯著增加(P＜0.01)，并且這兩組之間也有顯著性差異(P＜0.01)(表3)。

3 討論

圖3 Western blot檢測(cè)不同濃度INS下LO2細(xì)胞SPK1蛋白表達(dá)情況Fig 3 Expression of SPK1 protein in LO2 cells induced by different levels of insulin

目前，針對(duì)IR產(chǎn)生機(jī)制的研究日益受到醫(yī)學(xué)界的重視，而建立合理的IR模型是解決這些難題的基礎(chǔ)。體外建模的實(shí)驗(yàn)手段主要采用游離脂肪酸、高糖、三酰甘油、腫瘤壞死因子-α和INS作為誘導(dǎo)劑，研究對(duì)象主要有3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞、人肝胚胎瘤細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞等。肝細(xì)胞上密集分布著INS受體，參與維持體內(nèi)糖脂代謝平衡，對(duì)INS促進(jìn)GLU的攝取作用極為敏感，且肝腫瘤細(xì)胞本身就有IR作用［4-6］。相比較之下，采用人正常肝細(xì)胞LO2作為研究對(duì)象建立IR模型更可靠。也有人將LO2細(xì)胞作為研究對(duì)象，用高濃度INS誘導(dǎo)建立IR模型［7］，但誘導(dǎo)模型的最佳INS濃度和誘導(dǎo)時(shí)間卻不完全不同。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)胰島素體外誘導(dǎo)法來(lái)確定LO2細(xì)胞胰島素抵抗的最佳作用濃度及時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100和1 000 nmol/L INS作用48 h后細(xì)胞的葡萄糖吸收最低，故初步選擇100和1 000 nmol/L INS做為IR的誘導(dǎo)濃度。在作用36 h后，1 000 nmol/L INS的降糖作用最為明顯，而48 h后胰島素的降糖作用卻顯著下降，提示細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。在同樣作用時(shí)間內(nèi)，100 nmol/L INS未出現(xiàn)顯著的改變，因此最終選擇1 000 nmol/L INS作用48 h為胰島素抵抗發(fā)生模型。長(zhǎng)期IR會(huì)引發(fā)一系列代謝性疾病，如肥胖、脂肪肝和脂代謝紊亂等，是引起非酒精性脂肪肝和慢性肝臟疾病的最常見(jiàn)原因［8］。因此，推測(cè)產(chǎn)生IR的LO2細(xì)胞可能存在不同程度的脂肪變性。油紅O染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 000 nmol/L INS組細(xì)胞中脂滴增多明顯。線粒體氧化應(yīng)激與2型糖尿病IR發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系［9］。在2型糖尿病患者體內(nèi)，ROS生成過(guò)多或氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷，引起細(xì)胞功能障礙甚至凋亡［10］。熒光雙染方法結(jié)果表明，模型組線粒體ROS明顯比對(duì)照組多。Western blot結(jié)果提示，不同INS濃度的培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，SPK1的表達(dá)變化與INS的刺激有關(guān)，S1P可增加IR細(xì)胞攝取葡萄糖能力、改善糖代謝。因此，推測(cè)SPK/S1P通路可能參與胰島素抵抗機(jī)制的糖代謝，而其對(duì)血糖的調(diào)節(jié)以及糖代謝密切相關(guān)信號(hào)分子的影響將是下一步研究的重點(diǎn)方向。

表3 不同濃度的S1P溶液作用細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞上清中葡萄糖含量Table 3 The glucose levels in different time induced by different levels of S1P(x ± s，n=6)

［1］Abenavoli L，Masarone M，Peta V，et al．Insulin resistance and liver steatosis in chronic hepatitis C infection genotype 3［J］．World J Gastroenterol，2014，20:15 233-15 240．

［2］Ma MM，Chen JL，Wang GG，et al．Sphingosine kinase 1 participates in insulin signalling and regulates glucose metabolism and homeostasis in KK/Ay diabetic mice［J］．Dia-betologia，2007，50:891-900．

［3］郭紹東．組織特異性胰島素抵抗及其代謝綜合征的機(jī)制探討［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，15:1 435-1 442．

［4］高宇，宋光耀，周宇，等．高糖、高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗和血管舒張功能減弱［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26:275-279．

［5］曾靜波，李玉秀，王姮，等．胰島素抵抗糖尿病KKAy小鼠肌肉、肝臟組織PTEN的蛋白水平［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:166-168．

［6］林滬，毛青，王宇明，等．LO2細(xì)胞人鼠嵌合肝模型的建立［J］．中華肝病雜志，2006，14:578-581．

［7］李倩，王繼紅，王欣，等．人肝細(xì)胞系LO2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及鑒定［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34:4233-4236．

［8］RussoSB，Ross JS，Cowart LA．Sphingolipids in obesity，type 2 diabetes，and metabolic disease［J］．Handb Exp Pharmacol，2013，216:373-401．

［9］ Nishio S，Teshima Y，Takahashi N，et al．Activation of CaMKII as a key regulator of reactive oxygen species production in diabetic rat heart［J］．J Mol Cell Cardiol，2012，52:1103-1109．

［10］Aroor AR，Mandavia C，Ren J，et al．Mitochondria and oxidative stress in the cardiorenal metabolic syndrome［J］．Cardiorenal Med，2012，2:87-109．