劉師偉，王明明，王 軍，樓曉華，董艷婷，張 麗，趙術君，何玉潔

(1.山西醫(yī)科大學附屬大醫(yī)院內分泌科，山西太原030032;2.山西醫(yī)科大學研究生學院，山西太原030001;3.休斯敦Methodist代謝研究中心，休斯敦德克薩斯州美國77030;4.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦產科，山西太原030001)

胰島素抵抗是一個慢性亞臨床炎性反應過程，二者相互促動，引起機體內環(huán)境的改變［1-2］。炎性反應過程中分泌的大量炎性因子可干擾胰島素的生理作用，影響機體的能量攝入、存儲和代謝，促進胰島素抵抗的發(fā)生。Vaspin是從OLETF大鼠內臟脂肪組織中分離出來的一種具有胰島素增敏和抗感染效應的脂肪細胞因子。用Vaspin干預高糖及高脂誘導的肥胖ICR小鼠后，胰島素抵抗改善，增加糖耐量，并且與胰島素抵抗相關的基因(如瘦素、抵抗素和 TNF-α 等)表達下降［3］。

本研究探討Vaspin對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)TNF-α介導的NF-κB和PI3K/Akt信號通路的影響，及在血管內皮細胞中Vaspin作用于與肥胖相關的炎性反應及胰島素抵抗的機制。

1 材料與方法:

1.1 主要實驗材料

重組人Vaspin(Leinco Technologies公司);重組人TNF-α(Biovision公司);NF-κB熒光酶報告質粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］(Promega 公司);羊抗人ICAM-1一抗、羊抗人VCAM-1一抗、鼠抗人Akt一抗、鼠抗人磷酸化Akt一抗、IL-1和IL-6 ELISA試劑盒(R＆D Systems公司);鼠抗人MCP-1一抗(Gen Scipt公司);鼠抗人β-actin一抗(Sigma公司);HRP標記的鼠抗羊二抗和羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);SYBR Green Master Mix反應試劑盒(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代HUVECs的培養(yǎng):HUVECs取自新生兒臍帶。用0.1% Ⅰ型膠原蛋白酶溶液分離內皮細胞，將分離好的內皮細胞接種到鋪有明膠的25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清、ECGS、肝素、1×105U/L青霉素-100 mg/L鏈霉素的M199培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合80%以上時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 瞬時轉染和NF-κB熒光酶活力的測定:將2.5×105/mL的70% ～80%匯合的HUVECs接種于直徑 6 cm的培養(yǎng)皿，用 1.5 μL lipofectamine 2000、0.6 μg NF-κB 熒光酶報告質粒 pNF-κB-Luc和0.5 μg β-gal質粒共轉染，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中保溫6 h。作用6 h之后，更換含有血清的正常完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后用不同濃度(0～320 μg/L)Vaspin干預8 h，然后用10 μg/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用熒光素酶發(fā)光儀測定系統(tǒng)測定NF-κB熒光素酶活力。

1.2.3 Western blot分析:用0～320 μg/L Vaspin 預培養(yǎng)HUVEC 8 h，接著用10 μg/L TNF-α作用4 h后，采用Western blot檢測磷酸化的Akt以及ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白的表達水平。取細胞加蛋白提取液，加樣品電泳、轉膜、封閉和加相應一抗孵育，4℃過夜，再用HRP標記的二抗孵育1 h。用含0.05%Tween的PBS緩沖液漂洗膜3次，ECL化學發(fā)光后用Western blot檢測系統(tǒng)檢測。數據用Gel-Pro分析軟件進行分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR:用0～320 μg/L Vaspin培養(yǎng)HUVECs 8 h 后，再加入10 μg/L TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用 real-time PCR檢測下游分子 ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的mRNA的表達水平。用Trizol試劑按說明書提取HUVECs的總RNA。采用SuperScript First-Strand Synthesis System 將各5 μg RNA反轉錄為cDNA。實驗使用SYBR Green Master Mix反應試劑，反應在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)完成。PCR總反應條件為:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次，72℃10 min。延伸階段檢測熒光。數據由 ABI Prism 7000 SDS軟件分析。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.5 酶聯免疫分析(ELISA):用0～320 μg/L Vaspin 預培養(yǎng) HUVECs 8 h，再用10 μg/L TNF-α 作用4 h后，用ELISA試劑盒檢測經Vaspin和TNF-α處理后的HUVECs上清液中NF-κB下游炎性因子IL-1和IL-6的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數據以均數±標準差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 Vaspin對 TNF-α作用下HUVECs中 Akt磷酸化的影響

與對照組相比，Vaspin干預組中磷酸化的Akt水平呈劑量依賴性增加(P＜0.05)(圖1)。

2.2 Vaspin對 TNF-α作用下 HUVECs中 NF-κB熒光酶活力的影響

與對照組相比，Vaspin干預組中NF-κB熒光酶活力呈劑量依賴性被抑制(P＜0.05)(圖2)。

2.3 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs上清液中炎性因子IL-1和IL-6表達的影響

與對照組相比，Vaspin干預組中IL-1和IL-6的表達呈劑量依賴性下降(P＜0.05)(圖3)。

圖1 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導的Akt磷酸化的影響Fig 1 Effects of Vaspin on TNF-α-induced phosphorylation of Akt in HUVECs ± s，n=3)

圖2 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導的NF-κB熒光酶活力的影響Fig 2 Effects of Vaspin on TNF-α-induced NF-κB activity in HUVECs± s，n=3)

2.4 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1表達的影響

與對照組相比，Vaspin干預組中 ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的mRNA和蛋白表達呈劑量依賴性被抑制(P＜0.05)(圖4，5)。

3 討論

圖3 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導的炎性因子表達的影響Fig 3 Effects of Vaspin on TNF-α-induced expression of inflammatory cytokines in HUVECs± s，n=3)

圖4 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1基因表達的影響Fig 4 Effects of Vaspin on TNF-α-induced mRNA expressions of NF-kB downstream molecules ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs s，n=3)

炎性反應通過胰島素受體影響信號傳導通路IRS-1-PI3K-PKB/Akt是導致胰島素抵抗的主要分子機制。作為一種新的脂肪細胞因子，Vaspin具有胰島素增敏和抗感染效應［3-6］。本研究用Vaspin干預HUVECs后，磷酸化的Akt水平增加，表明Vaspin可使血管內皮細胞PI3K/Akt信號傳導作用增強，可能進一步作用于胰島素信號通路的下游分子，改善胰島抵抗，保護血管內皮細胞。但有報道Vaspin在大鼠血管平滑肌細胞可以抑制高糖誘導的PI3K/Akt信號通路［4］。這雖與本結果有差異，但都表明Vaspin可作用于PI3K/Akt信號通路，對血管平滑肌細胞或血管內皮細胞發(fā)揮保護作用。

圖5 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白表達的影響Fig 5 Effects of Vaspin on TNF-α-induced protein levels of NF-kB downstream molecules ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs(x ±s，n=3)

本文運用高敏感和高特異的NF-κB熒光酶報告系統(tǒng)，研究Vaspin對HUVECs中NF-κB轉錄活性的影響。顯示Vaspin可明顯抑制HUVECs由TNF-α介導的NF-κB轉錄活性，并減輕炎性反應。還有報道用 TNF-α處理 HUVECs 30 min后，Vaspin對NF-κB磷酸化作用不明顯［7］。本研究用 Vaspin作用于HUVECs 8 h可明顯抑制NF-κB磷酸化。

血管內皮細胞通過調節(jié)炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達來影響血管的功能［8］。NF-κB的激活促進炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及使血管內皮細胞內黏附分子ICAM-1和VCAM-1及趨化因子 MCP-1的表達增加，進而加重血管損傷［9-10］。本研究中，Vaspin 顯著抑制 HUVECs中TNF-α介導的 NF-κB的活化及其下游分子 IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及 MCP-1的表達。提示Vaspin可影響血管內皮細胞的炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達，保護血管內皮細胞，進一步阻止與肥胖和胰島素抵抗相關的心血管疾病的發(fā)生。

PI3K/Akt信號在調節(jié)NF-κB的激活存在爭議。通過激活PI3K/Akt信號的傳導，抑制NF-κB信號的傳導，可以抑制炎性反應［11-12］。也有報道抑制PI3K/Akt與NF-κB信號通路的傳導，同樣可發(fā)揮抗炎效應［13］。本研究中PI3K/Akt信號通路的激活可能與NF-κB信號通路的抑制存在直接或間接的關系，對此尚需進一步研究。

總之，Vaspin可作用于 HUVECs中 NF-κB和PI3K/Akt信號傳導通路，保護血管內皮細胞。這對闡明Vaspin與NF-κB和PI3K/Akt信號通路在肥胖和胰島素抵抗中的機制具有重要意義。

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