谷 海，王偉聿，鄭 灃，唐 莉

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500;2.云南省第一人民醫(yī)院生殖遺傳一科，云南昆明650032)

枸櫞酸氯米芬(clomiphene citrate，CC)因其可調(diào)節(jié)月經(jīng)、促排卵，具有價(jià)格低廉、使用方便、促排卵效果好等優(yōu)點(diǎn)，已成為微刺激促排卵方案中的一線藥物［1］，但是長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，CC能夠抑制子宮內(nèi)膜增殖，降低子宮內(nèi)膜厚度。因此，了解CC影響子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制，對(duì)不孕不育癥的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

課題組前期的研究結(jié)果顯示，CC對(duì)子宮內(nèi)膜增殖的抑制作用與細(xì)胞凋亡相關(guān)，但具體何種途徑或信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生尚不清楚［2］。已有的文獻(xiàn)表明線粒體途徑可能在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起到重要作用［3］。因此，本研究對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)的線粒體途徑進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)了與之密切相關(guān)的PI3K/AKT、JNK和NF-κB通路。以期初步探索CC影響子宮內(nèi)膜增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g［昆明醫(yī)學(xué)院，SCXK(滇)2011-0004］。

1.2 主要試劑

枸櫞酸氯米芬、戊酸雌二醇片，細(xì)胞線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，β-actin、PI3K、Cyt-c、mTOR、p-mTOR、Bax、Bcl-2、caspase-3、p-AKT、AKT、p-JNK、JNK、p-NF-κB 和 NF-κB 抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，鼠、兔源二抗(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠發(fā)情周期檢測(cè):早上8∶00開始實(shí)驗(yàn)，一直持續(xù)直到檢測(cè)出兩個(gè)完整發(fā)情周期才能開始進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每只大鼠都要經(jīng)過(guò)大約10～12 d的涂片檢查。將當(dāng)天處于發(fā)情前期的大鼠隨機(jī)分配入各組。

1.3.2 大鼠分組和模型建立:將10只SD雌性大鼠均分為對(duì)照組(CO)和實(shí)驗(yàn)組(CC)，對(duì)照組灌胃給0.9%氯化鈉溶液，實(shí)驗(yàn)組給CC(1 mg/kg)，持續(xù)給藥6天。另15只大鼠均分為3組，對(duì)照組(CO)、CC組和CC+E2組，對(duì)照組灌胃給0.9%氯化鈉溶液，實(shí)驗(yàn)組給CC和CC+E2，CC組給CC:1 mg/kg，CC+E2組給CC+E2 10 mg/只，持續(xù)給藥10 d。

1.3.3 子宮獲取:腹腔注射2%戊巴比妥鈉液(2 mL/kg)麻醉;固定后開腹取子宮，鈍性剔除子宮表面的脂肪組織;用刀片刮取內(nèi)膜組織放入凍存管于－80℃保存。

1.3.4 線粒體蛋白分離:按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)通路:采用Western blot方法對(duì) PI3K/AKT、JNK、NF-κB 通路中的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測(cè)。具體操作為:取0.5 g內(nèi)膜組織加入1.5 mL含有PMSF的RIPA裂解液中，在冰浴條件下進(jìn)行組織勻漿;4℃ 12 000 r/min離心10 min，去除沉淀后，上清即為提取的蛋白。使用Bio-Rad公司的蛋白定量試劑盒，并嚴(yán)格按照其說(shuō)明書要求測(cè)量總蛋白的濃度。根據(jù)各樣本蛋白濃度，計(jì)算各樣品相同蛋白量所需體積。蛋白樣品中加入2×上樣緩沖液，于95℃ 下變性5 min，室溫下冷卻后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后將其置于10%脫脂奶中(TBST緩沖液)封閉1 h，1×TBST洗3×5 min，加入特異性一抗(均為1∶1 000稀釋)4℃下過(guò)夜孵育，1×TBST洗3×5 min，再分別加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h，1×TBST洗2×5 min，1×TBS洗10 min，暗室中膜上加入ECL發(fā)光液，膠片曝光、顯影、定影。使用Quantity One 1.62軟件掃描膠片中各條帶的吸光度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間比較，單因素方差檢驗(yàn)比較各組間的差異(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠發(fā)情周期檢測(cè)

細(xì)胞個(gè)體較大，大部分呈橢圓形或近似橢圓形，有少量呈多邊形，細(xì)胞比圓形細(xì)胞更大(圖1A)，由此可以判斷為發(fā)情前期。出現(xiàn)了大量多邊形細(xì)胞，并且堆疊在一塊兒，這是角質(zhì)化后的表皮細(xì)胞，由此可以推斷為發(fā)情期或者發(fā)情后期(圖1B)，出現(xiàn)了大量的小圓細(xì)胞，這是大量的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，這是發(fā)情間期的明顯標(biāo)志(圖1C，D)。

2.2 相關(guān)信號(hào)通路檢測(cè)

2.2.1 CC給藥:與對(duì)照組相比，CC給藥組的Bax、caspase-3表達(dá)量增加(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P＜0.05)(圖2);細(xì)胞色素C(Cyt-c)從線粒體明顯釋放至胞質(zhì)中(P＜0.05)(圖3)。

CC能增強(qiáng)JNK和NF-κB的磷酸化水平(P＜0.05)(圖4)，激活JNK通路和NF-κB通路。同時(shí)，CC能夠下調(diào)PI3K的表達(dá)水平，降低抑制mTOR和AKT的磷酸化水平，從而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路(P＜0.05)(圖5)。

圖1 大鼠陰道細(xì)胞涂片觀察大鼠性周期Fig 1 Vaginal smear in rats estrous cycle(×40)

圖2 線粒體相關(guān)途徑的檢測(cè)Fig 2 Detecting of the mitochondria related pathway

圖3 細(xì)胞色素C的檢測(cè)Fig 3 Detecting of cytochrome C

2.2.2 CC和E2協(xié)同給藥:CC和CC與E2協(xié)同給藥比較發(fā)現(xiàn)，caspase-3蛋白的表達(dá)反而增加(圖6)，內(nèi)膜組織中總Cyt-c表達(dá)無(wú)明顯降低(圖6)，E2對(duì)線粒體途徑、NF-κB信號(hào)途徑和JNk信號(hào)途徑影響不顯著，只是在一定程度上抑制了 NF-κB的表達(dá)。CC和CC+E2給藥對(duì)此信號(hào)通路中某些蛋白表達(dá)量影響不顯著性(圖6，7)，然而在PI3K/AKT信號(hào)通路中，CC+E2組PI3K、p-mTOR、p-AKT蛋白表達(dá)量均呈顯著性增加(P＜0.05，圖8)。

圖4 JNK、NF-κB信號(hào)通路的檢測(cè)Fig 4 Detecting of JNK and NF-κB signal pathways

圖5 PI3K/AKT信號(hào)通路的檢測(cè)Fig 5 Detecting of PI3K/AKT signal pathways

圖6 線粒體相關(guān)途徑的檢測(cè)Fig 6 Detecting of the mitochondria related pathway

3 討論

本研究前期課題組已證實(shí)枸櫞酸氯米芬能夠使子宮內(nèi)膜厚度降低15%，同時(shí)檢測(cè)到了細(xì)胞凋亡的發(fā)生［2］。因此，推測(cè)CC對(duì)子宮內(nèi)膜厚度的影響，很有可能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡存在關(guān)聯(lián)。本研究中caspase-3的Western blot結(jié)果首先初步確認(rèn)了這一結(jié)果。隨后的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CC能夠促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，同時(shí)上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，這說(shuō)明CC主要通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。這也與既往的相關(guān)性研究結(jié)果相一致，如Selvaggi等［4］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的Bcl-2表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)。

圖7 JNK、NF-κB信號(hào)通路的檢測(cè)Fig 7 Detecting of JNK and NF-κB signal pathways

圖8 PI3K/AKT信號(hào)通路的檢測(cè)Fig 8 Detecting of PI3K/AKT signal pathways

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)了CC所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡涉及到了JNK和NF-κB信號(hào)通路的參與。JNK被各種物理、生物因素激活［5］，活化的JNK進(jìn)入細(xì)胞核激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如P53、c-Myc等和非轉(zhuǎn)錄因子，如Bcl-2家族［6］，通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子活性產(chǎn)生包括炎性反應(yīng)、增殖、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)［7］。NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，它控制細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和凝血系統(tǒng)一些成分的基因表達(dá)［8］，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移入核后啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，活化caspase-1進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡［9］。

此外，CC還能夠與子宮內(nèi)膜上雌激素受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)反應(yīng)(包括PI3K通路)，產(chǎn)生抗雌激素作用可影響子宮內(nèi)膜增殖［10］。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)CC給藥顯著抑制了PI3K信號(hào)通路;而在CC與E2協(xié)同給藥時(shí)，該通路的抑制作用消失。E2作為雌激素治療劑，同樣能夠與雌激素受體結(jié)合，因此在協(xié)同給藥時(shí)能發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)作用［11］。其拮抗CC的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了CC能夠?qū)I3K通路的調(diào)控作用。但E2并沒有影響CC對(duì)NF-κB和JNK信號(hào)通路中某些蛋白的表達(dá)。有研究表明［12］CC促排時(shí)加用小劑量雌激素可以緩解CC的抗雌激素作用引起的子宮內(nèi)膜厚度下降，但有人提出CC治療周期中加用雌激素可以增加子宮內(nèi)膜厚度，但并不能完全阻止CC導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡［13］，與本研究結(jié)果相吻合。

本研究發(fā)現(xiàn)了CC能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜上線粒體途徑的細(xì)胞凋亡以及雌激素受體結(jié)合，涉及到JNK，NF-κB，PI3K等多種通路的參與。研究結(jié)果為靶向消除CC在促排卵時(shí)所帶來(lái)的副作用提供了新的思考點(diǎn)。

［1］Homburg R．Clomiphene citrate—end of an era?A mini-review［J］．Hum Reprod，2005，20:2043-2051．

［2］王偉聿，唐莉．氯米芬對(duì)雌性SD大鼠子宮內(nèi)膜基因組表達(dá)影響及機(jī)制研究［D］．昆明理工大學(xué)，2014:21-41．

［3］Sivalingam VN，Myers J，Nicholas S，et al．Metformin in reproductive health，pregnancy and gynaecological cancer:established and emerging indications［J］．Hum Reprod Update，2014，20:853-868．

［4］ Selvaggi L，Depalo R．Apoptosis in normal ovaries of women with and without endometriosis［J］．Repord Biomed Online，2009，19:808-815．

［5］甄永占，林雅軍，駱廣玲，等．賴氨大黃酸通過(guò)激活 JNK誘導(dǎo)宮頸癌 HeLa細(xì)胞凋亡［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:68-72．

［6］Liu J，Lin A．Role of JNK activation in apoptosis:a double-edged sword［J］．Cell Res，2005，15:36-42．

［7］Elloumi-Mseddi J，Jemel-Oualha I，Beji A，et al．Effect of estradiol and clomiphene citrate on Erk activation in breast cancer cells［J］．J Recept Signal Transduct，2014:1-5．

［8］王丹陽(yáng)，朱廣瑾，徐成麗．NF-κ B在某些心血管疾病中的作用［J］基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1070-1073．

［9］Kottarathil VD，Antony MA，Nair IR，et al．Recent advances in granulosa cell tumor ovary:A review［J］．Indian J Surg Oncol，2013，4:37-47．

［10］Musgrove EA，Sutherland RL．Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer［J］．Nat Rev Cancer，2009，9:631-643．

［11］ Amita M，Takahashi T，Tsutsumi S，et al．Molecular mechanism of the inhibition of estradiol-induced endometrial epithelial cell proliferation by clomiphene citrate［J］．Endocrinology，2010，151:394-405．

［12］Nutu M，F(xiàn)eng Y，Egecioglu E，et al．Stromal cell-specific apoptotic and antiestrogenic mechanisms may explain uterine defects in humans after clomiphene citrate therapy［J］．Am J Obstet Gynecol，2010，203:65．e1-65．e10．

［13］Gonen Y，Casper RF．Jacobson W．et al．Endometrial thickness and growth during ovarian stimulation:a possible predictor of implantation in in vitro fertilization［J］．Fertil Steril，1989，52:446-450．