任文彥，郝宏蕾，王懷鋒，吳微微，蘇艷佳

（1.浙江省公安物證鑒定中心，浙江省刑事科學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310009；2.浙江警察學(xué)院，杭州310053）

GlobalFiler?試劑盒在尸骨鑒定中的應(yīng)用

任文彥1，郝宏蕾1，王懷鋒2，吳微微1，蘇艷佳1

（1.浙江省公安物證鑒定中心，浙江省刑事科學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310009；2.浙江警察學(xué)院，杭州310053）

目的 分析GlobalFiler?試劑盒在白骨化尸體身源認(rèn)定中的技術(shù)性能指標(biāo)。方法 采用硅珠法提取50份尸源認(rèn)定中的骨骼、牙齒樣本DNA，其中三聯(lián)體親權(quán)鑒定11份，二聯(lián)體親權(quán)鑒定39份，比較GlobalFiler?試劑盒和Identifiler Plus試劑盒檢驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果 GlobalFiler?試劑盒成功檢出了50份樣本STR分型。11份三聯(lián)體的尸源認(rèn)定中，兩種試劑盒計(jì)算得到的CPI值均能達(dá)到10 000以上，但GlobalFiler?試劑盒得到的累積父權(quán)指數(shù)（CPI值）更高，其中10份能達(dá)到108以上。39份二聯(lián)體的尸源認(rèn)定中，GlobalFiler?試劑盒得到的CPI均能達(dá)到10 000以上，而Identifiler Plus試劑盒得 到的CPI值能達(dá)到10 000以上的只有30例。而且GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增得到21個(gè)常染色體，Amel基因座和Y-indel、DYS391的分型信息，其特有的Y-indel 和DYS391兩個(gè)基因座，確保在Amelogenin基因座Y等位基因丟失的樣本中，可以成功檢出性別基因，防止性別誤判。結(jié)論 GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增可以獲得比目前常用的Identifiler Plus試劑盒更多基因信息，大大提高了身源鑒定中的CPI值，而且可以有效避免Amelogenin基因座Y等位基因丟失時(shí)導(dǎo)致的無(wú)名尸體性別誤判。因此，Globalfiler試劑盒在白骨化尸體身源認(rèn)定中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

法醫(yī)遺傳學(xué)；STR基因座；Y等位基因缺失；GlobalFiler?試劑盒；骨骼；牙齒；累積父權(quán)指數(shù)

在高度腐敗以及 白骨化尸體的尸源認(rèn)定中，骨骼牙齒由于其特殊的組織結(jié)構(gòu)，經(jīng)常是此類(lèi)案件中可用DNA檢驗(yàn)的唯一生物檢材。在檢驗(yàn)過(guò)程中，因其特殊性，對(duì)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)的要求更高。本研究對(duì)GlobalFiler?試劑盒在骨骼牙齒等硬組織類(lèi)樣本DNA擴(kuò)增中的效果應(yīng)用進(jìn)行了探討，并與目前常用的Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行比較，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本預(yù)處理

選取本實(shí)驗(yàn)室日常檢案積累需要親權(quán)鑒定的各類(lèi)長(zhǎng)骨25根，牙齒25顆，其中三聯(lián)體親權(quán)鑒定11份，二聯(lián)體親權(quán)鑒定39份。參照文獻(xiàn)［1，2］中的方法進(jìn)行前期處理和后期消化。用手術(shù)刀刮凈其表面，清洗。紫外燈下照射2 h，骨骼用電鉆鉆取約500 mg骨粉備用，牙齒用牙齒粉碎器砸成粉末備用。

1.2 主要儀器與試劑

Identifiler Plus試劑盒（美國(guó)ABI公司），Global Filer?試劑盒（美國(guó)ABI公司），3500XL基因分析儀（美國(guó)ABI公司），9700型擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），電鉆、牙齒粉碎器（公安部物證鑒定中心）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取骨粉及牙粉分別置于1.5 mL離心管中，加入400μL EDTA脫鈣液（0.5 mol/L，pH 8.0），10 μL DTT溶液（4 mol/L）、20 μL蛋白酶K溶液（20 mg/mL），充分混勻，在56℃的恒溫混勻儀上酶解12 h以上，采用硅珠法［3］進(jìn)行提取純化，30 μL洗脫體系。獲得的模板DNA采用GlobalFiler?試劑盒10 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系， DNA模板加入6μL。按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦程序在9700型擴(kuò)增儀中進(jìn)行29次循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用3500XL型基因分析儀進(jìn)行電泳分離，STR分型結(jié)果使用GeneMapper ID-X v1.4進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

檢驗(yàn)結(jié)果判定以峰高＞100 RFU（相對(duì)熒光單位）視為成功檢出。50份檢材均成功檢出STR分型，檢出率為100%。STR分型均較平衡。同時(shí)，在一份男性骨骼樣本中，之前采用Identifiler Plus試劑盒擴(kuò)增的分型中Amelogenin基因座出現(xiàn)了Y等位基因丟失的現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果容易誤判為女性分型（見(jiàn)圖1）。GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增的分型中Amelogenin基因座Y等位基因也同樣出現(xiàn)了丟失現(xiàn)象，但Y-indel和DYS391兩個(gè)基因座均擴(kuò)增出了等位基因，確證該骨骼樣本為男性樣本，而不是女性（見(jiàn)圖2）。

3 討 論

圖1 Identifi ler Plus試劑盒的分型結(jié)果Fig.1 Genotyping with Identifi ler Plus kit

圖2 GlobalFiler?試劑盒的分型結(jié)果Fig.2 Genotyping with GlobalFiler? kit

白骨化陳舊骨骼、牙齒等，由于DNA含量低，又有堅(jiān)硬的細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)，使得此類(lèi)生物檢材的檢驗(yàn)難度較大。GlobalFiler?試劑盒采用了6色熒光技術(shù)，對(duì)電泳儀的要求更高，所以未能得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于其在案件檢驗(yàn)中的效果，目前也鮮有報(bào)道。但其復(fù)合擴(kuò)增包含的基因座比較多，除了包含目前廣泛使用的Identifiler Plus試劑盒的15個(gè)基因座和性別基因座外，又增加了另外6個(gè)常染色體基因座D22S1045、SE33、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S441，同時(shí)還增加了Y-indel和DYS391兩個(gè)Y染色體遺傳標(biāo)記。試劑盒基因座的擴(kuò)增片段除了SE33大于400 bp之外，其余基因座都在400 bp以?xún)?nèi)，整體片段長(zhǎng)度較短，有利于提高擴(kuò)增成功率。本實(shí)驗(yàn)中50份骨骼、牙齒類(lèi)檢材的成功檢出說(shuō)明對(duì)于疑難的骨骼牙齒類(lèi)檢材，GlobalFiler?試劑盒完全能夠成功擴(kuò)增。

在本實(shí)驗(yàn)中，GlobalFiler?試劑盒一次擴(kuò)增可以獲得21個(gè)常染色體基因座STR分型結(jié)果，聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行親權(quán)鑒定的累積非父排除率（CPE）達(dá)0.999 999 9。而Identifiler Plus試劑盒包含的15個(gè)STR基因座聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行親權(quán)鑒定的累積非父排除率（CPE）為0.999 998 8。相比Identifiler Plus試劑盒而言，GlobalFiler?試劑盒具有更高的系統(tǒng)效能。從實(shí)驗(yàn)獲得的STR分型來(lái)計(jì)算累積父權(quán)指數(shù)（CPI值）可以看出（見(jiàn)表1），11份三聯(lián)體的尸源認(rèn)定中，兩種試劑盒計(jì)算得到的CPI值均能達(dá)到10 000以上，但GlobalFiler?試劑盒得到的CPI值更高，其中10份能達(dá)到108以上。39份二聯(lián)體 的尸源認(rèn)定中，GlobalFiler?試劑盒得到的CPI均能達(dá)到10 000以上，而Identifiler Plus試劑盒得到的CPI值只有30例在10 000以上。

GlobalFiler?試劑盒中包含的Y-indel和DYS 391兩個(gè)基因座對(duì)于某些Amelogenin基因座Y等位基因丟失的白骨化尸體的性別鑒定很有意義。目前，男性Amelogenin基因座Y等位基因丟失的案例屢有報(bào)道［4，5］。Amelogenin性別基因座位于Y染色體的短臂，而Y-indel和DYS391位于Y染色體的長(zhǎng)臂區(qū)域，而且Y-indel插入缺失多態(tài)性位點(diǎn)非常短（60 bp），如果DYS391發(fā)生缺失的時(shí)候，對(duì)極度降解樣品也仍然有高分辨能力。額外的性別鑒定標(biāo)記可以在Amelogenin基因座Y等位基因丟失的情況下，保證能夠準(zhǔn)確鑒定白骨化尸體的性別，這對(duì)于尸源認(rèn)定很有幫助，可以避免由于Y等位基因的丟失而將男性尸骨誤判為女性尸骨。本實(shí)驗(yàn)中的一份骨骼樣本經(jīng)Identifiler Plus試劑盒擴(kuò)增后結(jié)果顯示為一女性分型，而經(jīng)GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增后提示該骨骼樣本應(yīng)為男性。可見(jiàn)，對(duì)于此類(lèi)Amelogenin基因座Y等位基因丟失的檢材，采用GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增，可以有效避免對(duì)該類(lèi)尸骨的性別誤判，避免給偵查工作帶來(lái)困擾。

表1 Identifi ler Plus和GlobalFiler?CPI值比較Table1 CPI values obtained with Identifi ler Plus and GlobalFiler?

此外，GlobalFiler?試劑盒擴(kuò)增時(shí)間更短，只需80 min。并且對(duì)于骨骼牙齒類(lèi)檢材來(lái)說(shuō)，一般DNA模板含量較少，采用無(wú)水?dāng)U增時(shí)，10 μ L體系下， GlobalFiler?試劑盒的模板體積可到6 μ L，相對(duì)提高了模板DNA濃度，也在一定程度上提高了檢測(cè)成功率，對(duì)于微量骨骼DNA模板，可以嘗試GlobalFiler?試劑盒。

綜上，GlobalFiler?試劑盒在檢出率、平衡性方面也都能夠滿(mǎn)足檢驗(yàn)需要，尤其是只需一次檢驗(yàn)即可得到21個(gè)常染色體STR 基因座和3個(gè)性別基因座的分型信息，不僅在單次檢驗(yàn)中提供的基因座更多，可顯著提高累積親權(quán)指數(shù)，而且可以有效避免Amelogenin基因座Y等位基因丟失時(shí)導(dǎo)致的無(wú)名尸體性別誤判，在白骨化尸體身源認(rèn)定中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 涂政，劉志芳，陳松，等.牙齒的DNA提取及STR分型研究［J］.刑事技術(shù)，2007（5）:9-10.

［2］ 涂政，陳松，趙龔，等.66年骨骼檢驗(yàn)1例［J］.刑事技術(shù)，2011（3）:48-49.

［3］ 王林生，蘇勇，顧林崗.硅珠法提取PCR模板DNA［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2000，15（1）:36-37.

［4］ 洪強(qiáng)，薛佳，陶莉，等.Y染色體DNA分型異常2例［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2014（1）:23.

［5］ Chang YM， Perumal R， Keat PY， et al.A distinct Y-STR haplotype for Amelogenin negative males characterized by a large Yp11.2 （DYS458-MSY1-AMEL-Y） deletion ［J］.Forensic Sci Int， 2007，166（2）:115-120.

引用本文格式：任文彥， 郝宏蕾， 王懷鋒， 等.GlobalFiler?試劑盒在尸骨鑒定中的應(yīng)用 ［J］.刑事技術(shù)，2015，40（5）:379-381.

Identifi cation of Unknown Corpses Using GlobalFiler? Kit

REN Wenyan， HAO Honglei， WANG Huaifeng， WU Weiwei， SU Yanjia
（1.Zhejiang Key Laboratory of Forensic Science and Technology， Institute of Forensic Science of Zhejiang Provincial Public Security Bureau， Hangzhou 310009， China； 2.Zhejiang Police College， Hangzhou 310053， China）

Objective To analyze the performance of GlobalFiler? kit testing bones of corpses.Methods Silicon bead method was used to extract DNA from 50 samples of bones and teeth that were all required to determine their source with 11 of them waiting for the triplet and the rest 39 ones the duo paternity testing.The GlobalFiler? kit and Identifi ler Plus kit were employed to evaluate their testing competence and cumulative paternity index （CPI） values.Results GlobalFiler? kit successfully detected the STR types of the 50 samples.For identifi cation of cadaveric source of the 11 triplet cases， although both kits showed to have CPI values greater than 10，000， the GlobalFiler? kit performed even better with its CPI larger than 108in 10 out of the 11 cases， much higher than that of Identifi ler Plus kit.For the 39 duo cases， GlobalFiler? kit again elevated its CPI≥10，000 while the Identifi ler Plus kit was only 30.Furthermore， GlobalFiler? kit can expose the genotyping of 21 autosome， Amelogenin， Y-indel and DYS391， especially with the last two exclusive loci for the kit to be capable of determining gender when samples are even of Y-allele-absence in Amelogenin.Conclusions GlobalFiler? kit， capable of amplifying more loci in a single run of amplifi cation than the widely used Identifi ler Plus kit， has greatly increased the CPI for identifying unknown bodies.Moreover， its additional Y-chromosome loci can help determine gender more effectively.Therefore， GlobalFiler? kit is high applicable in identi fying unknown bodies.

forensic genetics； STR loci； Y-allele absence； GlobalFiler? kit； bone； teeth； cumulative paternity index （CPI）

DF795.2

B

1008-3650（2015）04-0379-03

10.16467/j.1008-3650.2015.05.008

公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.201202ZDYJ007）

任文彥（1984—），男，山西呂梁人，主檢法醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: sxwenyan@sina.com

2015-02-16