豐 蕾，楊 帆，李彩霞，徐 珍，凃 政，李萬水，胡 蘭，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京 100038；2.上海市公安局刑偵總隊，上海 200083）

單細胞分離檢驗技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究

豐 蕾1，楊 帆2，李彩霞1，徐 珍1，凃 政1，李萬水1，胡 蘭1，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京 100038；2.上海市公安局刑偵總隊，上海 200083）

法醫(yī)單細胞分離檢驗技術(shù)是微量混合DNA樣本檢驗最有效的方法之一。 常規(guī)的單細胞分離檢驗技術(shù)包括單細胞分離、單細胞裂解、PCR擴增、數(shù)據(jù)分析。本文將詳細介紹單細胞分離檢驗技術(shù)原理和應(yīng)用進展，同時展望了單細胞測序在法醫(yī)DNA的應(yīng)用前景。近5年來，單細胞分離、全基因組擴增和二代測序技術(shù)的結(jié)合而產(chǎn)生的單細胞測序技術(shù)，將 為法醫(yī)遺傳學(xué)檢測提供一種全新的技術(shù)和思路，尤其為微量混合生物樣品檢驗提供全新的技術(shù)手段。

法醫(yī)遺傳學(xué)；單細胞分離檢驗技術(shù)；微量混合樣本；單細胞測序；二代測序

生物體是由單個細胞構(gòu)成的，人體大約由不同組織的3.72×1013個細胞組成［1］。微量混合DNA的檢驗一直都是法醫(yī)DNA檢驗的難題。雖然通過計算的方法可以對混合DNA圖譜拆分解釋［2，3］， 但是對于復(fù)雜混合圖譜，比如一個成分占主要時次要成分的檢驗，或者3人以上混合圖譜的解釋就非常困難。細胞分離是一種獲得單一個體DNA分型相對直接的方式，低至幾個細胞甚至單個細胞的單細胞檢驗技術(shù)［4］也是微量DNA檢驗的有效途徑。以高通量為特點的第二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），能夠?qū)资f條DNA同時測序，實現(xiàn)了快速、高效、低成本的測序［5］。近幾年來，單細胞分離技術(shù)和二代測序技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的單細胞測序（single-cell sequencing， SCS）技術(shù)［6］將為法醫(yī)DNA檢驗帶來全新的技術(shù)手段。

1 單細胞分離

單細胞分離的方法很多，包括顯微操作技術(shù)（micromanipulation）、激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection， LCM）、 微流控技術(shù)（microfluidic platforms）等。目前在法醫(yī)DNA檢驗中實際應(yīng)用的技術(shù)平臺有兩種，顯微操作技術(shù)和激光捕獲顯微切割技術(shù)。

1.1 細胞染色

由于在實際案件中獲得的細胞，細胞形態(tài)并不是實驗室理想的形態(tài)，為了更好的識別細胞，在普通顯微鏡下觀察時需要對細胞進行染色。對于上皮細胞，我們研究組嘗試了不同的染色方法，通過聯(lián)用顯微操作技術(shù)對龍膽紫濃度梯度及時間梯度染色進行研究發(fā)現(xiàn)，0.5μ L龍膽紫染液（0.05g/mL）加入100μL細胞懸液，5 min后胞核著色即已明顯，能有效提高顯微捕獲單細胞分離檢驗技術(shù)的檢測效能，另外，染色時間不影響DNA結(jié)果分析［7］。對于精子細胞染色，Di Martino等通過對比核固紅與巴氏染色法，證實巴氏染色法不僅能清晰的觀察精子細胞，而且不影響下游PCR擴增［8］。Sanders等通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，蘇木素/伊紅染色法（H&E）染色后的精子細胞STR分型峰高下降幅度較小，不影響分型結(jié)果［9］。也可以用熒光原位雜交技術(shù)對精子細胞的性染色體進行標(biāo)記［10］。

1.2 顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù)是在顯微鏡下通過微毛細管吸取單個細胞。典型的顯微控制系統(tǒng)包含一個倒置顯微鏡加上一個操縱桿操作，電動精密控制平臺。其優(yōu)點是操作容易進行，通過顯微鏡直觀地分離單個細胞，成本低，主要用于較小細胞群體中的目標(biāo)細胞分離。該平臺適合對案件中上皮細胞進行分離，3個口腔上皮細胞平行16次試驗均可獲得完整分型，甚至低至一個細胞也可得到完整分型，該方法已成功應(yīng)用于一起強奸案的檢驗。在該案件中，提取受害人皮膚上的唾液斑，通過在鏡下分離有核的口腔上皮細胞（來自于犯罪嫌疑人）和無核角化的上皮細胞或細胞碎片（來自于受害者皮膚），成功獲得嫌疑人的STR分型［4，11］。在案件中常碰到的血煙頭檢材，由于血液量大，常規(guī)方法很難獲得煙頭上唾液來源個體的STR分型，即使用單細胞分離檢驗時，也常常獲得混合STR分型。本課題組在顯微操作標(biāo)準(zhǔn)流程的基礎(chǔ)上進行改進，將吸取的細胞先在TNE緩沖液中清洗幾次，以徹底去除血液細胞碎片和游離DNA，最終獲得完整唾液來源個體的DNA分型［12］。也有報道將顯微操作分離的方法用于精子分離［13，14］，但精子細胞體積非常小，直徑只有約6μ m，毛細管吸取操作相對困難，下面介紹的激光捕獲顯微切割技術(shù)平臺更加適合精子細胞的分離操作。

顯微操作法存在以下幾個方面的不足。第一，由于依賴手工操作，對實驗員的經(jīng)驗與操作能力要求較高，自動化程度較低，而且玻璃吸針脆性大，操作時易碎。第二，耗時較長，操作繁瑣。第三，對于涂片后的檢材，必須在液體環(huán)境下進行操作，容易受蒸發(fā)的影響，檢材蒸干后，再補水時容易造成檢材的損失，甚至帶來污染。第四，對于案件中陳舊樣本，根據(jù)形態(tài)識別細胞容易出錯。

1.3 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)是利用UV（320～400nm）激光切割并捕獲涂于覆膜玻片上的細胞。儀器設(shè)備較昂貴，自動化程度較顯微操作技術(shù)平臺高，是目前法醫(yī)學(xué)應(yīng)用最有效的單細胞分離方法，可用于上皮細胞、精子細胞、白細胞等不同類型的細胞分離。目前，該平臺應(yīng)用較多的是性侵案中差異裂解法無法消除女性成分干擾的精斑檢材，通過在顯微鏡下尋找并捕獲精子細胞以消除女性成分。由于精子細胞是單倍體，理論計算證明捕獲15～20個未降解的精子細胞，有很高的可能性獲得完整的STR分型［15］，實驗證明至少捕獲30個精子細胞可獲得完整的STR分型。也有學(xué)者應(yīng)用懸液熒光原位雜交（suspension fluorescence in situ hybridization，S-FISH）對性侵案樣本進行標(biāo)記，通過這種方法可以明顯減少前處理操作步驟［16］。

對于多個精子貢獻者的混合精斑，差異裂解法不能將每個貢獻者完全分離。近年來，我們研究組在這方面有深入的研究。通過聯(lián)合使用激光捕獲顯微切割方法和低體積擴增技術(shù)，可以實現(xiàn)以單個精子細胞DNA為模板，進行Y-STR擴增檢測，并成功獲得三人混合精斑中各個來源人的Y-STR分型［10］。研究組進一步使用熒光原位雜交技術(shù)標(biāo)記Y型精子，特異性挑選Y型精子，通過優(yōu)化組合Y-STR基因座與10個常染色體STR基因座（auto-STR），構(gòu)建全新的YA-STR復(fù)合系統(tǒng)。其中，Y-STR基因座用于區(qū)分不同個體，通過組合Y-STR相同的圖譜，實現(xiàn)個體的常染色體STR分型檢驗。首次嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于三人混合精斑的檢驗，準(zhǔn)確地獲得了三個個體的STR分型［17］。近年來，我們研究組還利用該平臺建立了男女混合血液樣本的分離檢驗技術(shù)方法［18］。該平臺在尋找細胞這一步驟時耗時耗力。有研究組開發(fā)了自動化的圖像識別軟件，通過分析圖像中的光強、顏色和形狀，可實現(xiàn)快速識別細胞［16，19］，但是對不同種類細胞準(zhǔn)確快速的識別仍需要進一步的研究。

1.4 微流控技術(shù)

最近興起的微流控技術(shù)平臺因其高通量、自動化、可有效防止污染而備受關(guān)注。微流控裝置封閉的操作空間可以有效地避免污染，微升至納升的操作體積可以保證較高的樣品濃度，同時減少試劑消耗［20，21］，雖然目前還沒有在法醫(yī)學(xué)單細胞分離中實際應(yīng)用，但未來有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 單細胞裂解

分離得到單細胞后，需將細胞裂解獲得基因組DNA。傳統(tǒng)的法醫(yī)DNA檢測需要對基因組DNA進行純化，而對于單細胞檢驗，為了避免DNA的損失，常略去純化步驟，裂解后直接進行PCR擴增。因此，裂解步驟要保證不影響后續(xù)PCR擴增反應(yīng)的順利進行。目前主要使用蛋白酶裂解， 常用蛋白酶K或Protease（德國QIAGEN公司），酶解后高溫使胞內(nèi)蛋白質(zhì)及蛋白酶K變性失活，利于基因組DNA的釋放和下游PCR反應(yīng)。對于精子細胞可加入DTT，打斷二硫鍵，使細胞充分裂解［10，22］。

3 PCR擴增

一個細胞中的總DNA量僅有數(shù)匹克，常規(guī)的PCR管擴增需要的細胞數(shù)目較多，我們的研究結(jié)果顯示至少20個口腔上皮細胞或60個精子細胞檢測到Identifiler? PCR 試劑盒（美國ABI公司）中全部分型。最近幾年發(fā)展起來的微量化反應(yīng)，即芯片-低體積PCR擴增（on-chip low volume-polymerase chain reaction，LV-PCR）系統(tǒng)［23， 24］，在低至1.5 μL的PCR體系中，DNA模板與引物和聚合酶結(jié)合的機會明顯提高，使微量細胞甚至單個細胞進行DNA分型變?yōu)楝F(xiàn)實，不僅檢測的靈敏度得到提高，而且檢驗范圍也大大拓寬了。LV-PCR使用貝克曼公司的AG480F AmpliGrid slide進行擴增，前期大量的研究都是使用該產(chǎn)品進行，而且實驗證明該產(chǎn)品靈敏度、準(zhǔn)確性可滿足法醫(yī)單細胞檢驗的要求。

另外一種最新的方法也值得關(guān)注，是在微液滴里進行PCR擴增。首先將單個細胞和熒光標(biāo)記引物結(jié)合的微珠隨機擴散在1.5 nL的油包裹的瓊脂微流液滴中，在大量微液滴內(nèi)進行平行的PCR擴增反應(yīng)后，于 PCR擴增管內(nèi)進行二次擴增，常規(guī)毛細管電泳檢測［25］，通過對大量單個細胞進行平行9重STR檢測，獲得混合樣本各成分的STR分型。

4 數(shù)據(jù)分析

單細胞檢驗由于DNA模板量非常低，其缺帶、多帶等現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，stutter峰較常規(guī)擴增強，單細胞檢驗的數(shù)據(jù)分析和低拷貝DNA的分析方法類似，需平行擴增，綜合多次結(jié)果獲得最終的STR分型［26，27］。一般來說至少需獲得5次有效分型（獲得13個基因座以上的結(jié)果）［28］，重復(fù)3次及以上的位點才能確認為有效位點。

5 單細胞測序

在二代測序技術(shù)和全基因組擴增技術(shù)（whole genome amplification， WGA）發(fā)展的基礎(chǔ)上，2011年，Navin等人首次發(fā)明了單細胞測序（single-cell sequencing， SCS）技術(shù)［6］，測定了人體單個細胞的基因組DNA。單細胞測序的文章呈逐年遞增狀態(tài)，從2011～2014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物學(xué)多個領(lǐng)域，發(fā)表于生物學(xué)頂級期刊上［28］。2013年，《科學(xué)》雜志將單細胞測序列為年度領(lǐng)域榜首，《自然方法》雜志將單細胞測序列為2013年年度最重要的方法學(xué)進展。

5.1 全基因組擴增技術(shù)

由于單個細胞DNA含量有限，需進行全基因組擴增才能滿足二代測序的最低DNA量。目前，已有多種以單個基因組為模板的全基因擴增技術(shù)，簡稱寡核苷酸引物PCR 技術(shù)（degenerate oligonucleotide primed PCR， DOP-PCR）和多重置換擴增技術(shù)（multiple displacement amplification， MDA）。其中DOP-PCR方法覆蓋率低，但可獲得準(zhǔn)確的拷貝數(shù)［6］。MDA方法是在恒溫下利用具有強模板結(jié)合的phi29DNA 聚合酶和六聚物進行鏈置換擴增反應(yīng)。Phi29DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，并且具有特殊的多重置換和連續(xù)合成特性，產(chǎn)生的DNA片段較大，約為50～100 kb，可以覆蓋基因組的90%以上，和DOP-PCR方法一樣也會產(chǎn)生不同區(qū)域擴增不平衡性，MDA方法產(chǎn)生的不平衡性不具有重復(fù)性［29］。2012年，首次報道了基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles， MALBAC），該方法結(jié)合MDA 擴增技術(shù)和PCR 擴增技術(shù)的優(yōu)勢，利用特殊設(shè)計的引物，巧妙地使擴增子的結(jié)尾通過互補而成環(huán)，進而在一定程度上防止了基因組DNA 的指數(shù)性擴增，明顯降低了擴增偏倚性，并顯著提高覆蓋度［22］，但是該方法使用Bst聚合酶，沒有校錯活性（proofreading activity）?，F(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒各項參數(shù)見表1。全基因組擴增技術(shù)雖然仍然會有基因缺失等問題，但是相信隨著時間的推移和技術(shù)的進步，擴增的準(zhǔn)確性會逐步提高。

表1 不同單細胞全基因組擴增試劑盒參數(shù)比較［29］Table1 Comparison of key parameters among single-cell whole-genome amplifi cation kits

5.2 二代測序技術(shù)

對單細胞全基因組擴增后進行二代測序。二代測序技術(shù)具有快速、高效、低成本的優(yōu)點［5］。近兩年來的研究表明，二代測序結(jié)果的準(zhǔn)確性很高，與傳統(tǒng)的Sanger測序相當(dāng)［30］。二代測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用研究很多，目前已經(jīng)有兩種商業(yè)化的試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司開發(fā)的基于SNP 的the HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel和the HIDIon AmpliSeqTMAncestry Panel，主要通過SNP檢測進行個體識別和祖先推斷；美國Illumina公司開發(fā)的ForenSeqTMDNA Signature Prep Kit，在一個PCR反應(yīng)中可以同時擴增27個常染色體STR， 8個X-STR，25個Y-STR，95個個體識別SNPs，56個祖先信息標(biāo)記（ancestry informative markers， AIMs）和24個顯性特征SNPs，更適合法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。這兩個公司使用的測序技術(shù)的優(yōu)缺點見表2。

表2 兩種法醫(yī)學(xué)二 代測序試劑盒比較Table2 Comparison of key parameters between two forensic NGS kits

6 單細胞檢驗展望

目前單細胞測序尚未應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，但是具有很好的應(yīng)用前景，是單細胞檢驗未來發(fā)展的重要方向。單細胞全基因組擴增后，利用二代測序大量平行測序的特點，對幾百個甚至幾千個細胞進行平行測序，相當(dāng)于對一個樣本進行數(shù)百次檢測，通過重復(fù)測定可部分克服全基因組擴增帶來的基因缺失的不足。再者，該技術(shù)可以檢測混合樣本中次要成分的STR分型或者三人及以上混合樣本，一次獲得不同個體的STR、SNP等多種遺傳標(biāo)記。目前，單細胞測序成本偏高，需進一步研發(fā)多重單細胞DNA測序平臺，能夠以較低的成本平行檢測數(shù)百個細胞，另外，作為第三代測序技術(shù)的單分子實時測序可直接“讀取”DNA序列［30］，也是未來發(fā)展方向之一。

總之，微量混合生物樣本的檢驗一直是制約DNA檢驗技術(shù)發(fā)揮作用的瓶頸，傳統(tǒng)的單細胞檢驗技術(shù)因其高靈敏度、可特異性挑選細胞的優(yōu)勢已經(jīng)應(yīng)用到實際案件中微量混合生物樣本的檢驗，而單細胞測序技術(shù)結(jié)合了二代測序技術(shù)大規(guī)模平行檢測的特點，將為微量混合生物樣品檢驗提供一種全新的技術(shù)手段。

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引用本文格式：豐蕾，楊帆，李彩霞，等.單細胞分離檢驗技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究 ［J］.刑事技術(shù)， 2015，40（5）:359-363.

Single Cell Separation Testing and Its Forensic Application

FENG Lei1， YANG Fan2， LI Caixia1， XU Zhen1， TU Zheng1， LI Wanshui1， HU Lan1，*
（1.Key Laboratory of Forensic Genetics of Ministry of Public Security， Institute of Forensic Science of Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Institue of Forensic Science， Shanghai Municipal Public Security Bureau， Shanghai 200083， China）

Forensic single cell separation testing technology is one of the most effective ways for trace and mixture DNA sample testing.Traditional single cell separation testing technology includes single cell isolation and lysis， PCR amplifi cation and data analysis.This article details the principle of traditional single-cell separation and its application in case testing，meanwhile places the focus on prospect of single-cell sequencing （SCS） technology into forensic application.The research on SCS has shown tremendous growth over the past fi ve years， and impacted many diverse areas of biological research.However，the study in forensic genetics is as yet waiting for developing.SCS is a combination of the single cell isolation， similar to the traditional single cell separation， with whole-genome amplifi cation and next generation sequencing.In this review， the whole genome amplification and next generation sequencing （NGS） were summarized together with the advantages and disadvantages of the current technologies analyzed.Until now， there are some commercial kits of whole-genome amplifi cation for biological research and ones of next generation sequencing for forensic application.Although the SCS technology is still relatively new， it has been being developed rapidly and will provide new means for forensic testing， especially for trace and mixture sample testing.The grounds root at the quantity-enormous parallel sequencing of NGS that is relied with SCS.This implementation can make one single sample tested hundreds of times so that such repetitious verifi cation will defi nitely produce more complete and accurate information.Besides， next generation sequencing can bring the minor component in mixed sample into its STR types， even leading the mixture containing substance of three or more persons to evidential results，therefore exposing various genetic markers like STR， SNP from different individuals in just one single run of detection.Additionally， the real-time single molecule’s sequencing by the third generation sequencing will set a progressive aspiration for forensic genetics with the direct reading DNA sequence.

forensic genetics； single cell separation technique； trace and mixture sample； single-cell sequencing；next generation sequencing

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0359-05

10.16467/j.1008-3650.2015.05.003

公安部科技強警基礎(chǔ)工作專項項目（No.2014GABJC040）

豐 蕾（1984—），女，副主任法醫(yī)師，博士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: fengleink@163.com

胡 蘭，女，主任法醫(yī)師，博士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: hulan328@139.com

2015-07-22