孫啟凡，趙 蕾，徐 穎，王 瑋，龍 源，馬紀(jì)強(qiáng)，魏以梁，趙興春，葉 健，李彩霞，*

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.北京市現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038； 4.中國(guó)刑警學(xué)院， 沈陽 110854；5.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030024；6.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100084；7.天津醫(yī)科大學(xué)表觀遺傳中心，天津 300070）

遺傳病推斷復(fù)合擴(kuò)增體系的構(gòu)建

孫啟凡1，2，3，趙 蕾1，2，3，徐 穎1，4，王 瑋1，5，龍 源1，馬紀(jì)強(qiáng)1，魏以梁6，7，趙興春1，2，3，葉 健1，2，3，李彩霞1，2，3，*

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.北京市現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038； 4.中國(guó)刑警學(xué)院， 沈陽 110854；5.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030024；6.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100084；7.天津醫(yī)科大學(xué)表觀遺傳中心，天津 300070）

目的 通過對(duì)人類DNA進(jìn)行突變基因檢測(cè)推斷該DNA供者是否患特定遺傳病，建立對(duì)DNA樣本突變

法醫(yī)遺傳學(xué)；等位基因特異性PCR；毛細(xì)管電泳；遺傳性耳聾；β-地中海貧血；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥

遺傳病是指由遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的或者是由致病基因所控制的疾病，對(duì)人類DNA進(jìn)行檢測(cè)理論上可推斷該DNA供者是否患有某種類型的遺傳?。?］。多數(shù)遺傳病具有地域性或家族遺傳性，因此，挑選特定的疾病類型，通過對(duì)DNA的檢測(cè)，可推斷供者是否可能具備遺傳病特征，從而間接推斷DNA供者的地域來源、生活習(xí)性等，一定程度上能夠縮小嫌疑人的目標(biāo)人群，為案件偵查提供線索。而針對(duì)突變基因位點(diǎn)或致病基因建立簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)方法是開展此類研究需要解決的關(guān)鍵問題。等位基因特異性PCR（allele specific PCR， ASPCR）技術(shù)是一種簡(jiǎn)便易行的基因序列分析方法［2］，根據(jù)基因的堿基序列差異設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，通過PCR 技術(shù)獲得等位基因特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過電泳直接分析條帶的有無而最終確定突變分型。本文基于等位基因特異性PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)，建立了一個(gè)可同時(shí)檢測(cè)遺傳性耳聾、β-地中海貧血（β-Mediterranean anemia）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥三類遺傳疾病的復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，適用于國(guó)內(nèi)一般法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1 材料和方法

1.1 樣本及DNA提取

收集健康個(gè)體（北京）樣本（血卡或外周靜脈血）20份，301醫(yī)院幫助收集耳聾患者DNA樣本35份；血卡樣本使用QIAamp? DNA Mini M48（德國(guó)Qiagen公司）提取DNA，新鮮外周靜脈血使用QIAamp? DNA Blood Midi Kit（德國(guó)Qiagen公司）提取血樣的DNA。使用AB7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司）進(jìn)行DNA定量。

1.2 位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)3種疾病各突變位點(diǎn)在中國(guó)人群中的出現(xiàn)概率，挑選了20個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行體系構(gòu)建。引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇HEX和FAM兩種熒光對(duì)引物對(duì)中的上游引物進(jìn)行特異性標(biāo)記。

1.3 復(fù)合擴(kuò)增體系構(gòu)建及檢測(cè)分析

使用ABI 9700 PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司）擴(kuò)增。5.0 μL PCR體系，包含：0.5 μL等比例混合的引物混合物，0.05 μL的dNTP （10 mM），0.5 μL 10×PCR buffer（15 mM Mg2+），0.7 μL MgCl2（25 mM Mg2+），0.2 μL快速啟動(dòng)酶Hotstar Taq plus（5 U/μ L），1.05 μL去離子水，2 μL模板DNA。

擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；之后94℃ 30 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；60℃ 45 min。

使用ABI 3100XL型自動(dòng)遺傳分析儀（美國(guó)Life Technologies公司）進(jìn)行電泳，利用Genemapper ID v3.2 軟件（美國(guó)Life Technologies公司）分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 疾病類型選取原則

對(duì)中國(guó)人群中常見遺傳病情況調(diào)查研究，認(rèn)為適合用于DNA人物特征推斷研究的遺傳病需具備的特征包括：（1）具備一定的發(fā)病率；（2）表型特征、地域特征或家族聚集特征明顯；（3）具備一定的臨床研究基礎(chǔ)，突變位點(diǎn)清楚。本文選擇了三種單基因遺傳病作為研究對(duì)象，分別是：β-地中海貧血、遺傳性耳聾、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥。β-地中海貧血是一類以珠蛋白β鏈合成不足或缺失為特征的常染色隱性遺傳性疾病，在我國(guó)主要分布在南方，如廣東、廣西、海南、香港等地區(qū)。其中廣東和廣西兩省人群中，β-地貧基因攜帶率高達(dá)23.98%［3］。耳聾是一類具有顯著遺傳異質(zhì)性的疾病，是影響交流的最常見的感覺障礙，新生兒重度以上先天性耳聾發(fā)病率為1/1000［4］。G6PD是最常見的人類酶缺陷病之一，常見于我國(guó)南方人群，尤其是兩廣地區(qū)［5］。

2.2 體系構(gòu)建

復(fù)合擴(kuò)增體系共包含三種疾病的20個(gè)位點(diǎn)，其中耳聾突變位點(diǎn)11個(gè)，β-地中海貧血突變位點(diǎn)6個(gè)，G6PD缺乏癥突變位點(diǎn)3個(gè)。針對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)建立兩組引物，野生型和突變型各一對(duì)，分兩管擴(kuò)增，其中野生型20個(gè)位點(diǎn)為一組，突變型20個(gè)位點(diǎn)為一組，各突變位點(diǎn)及引物信息見表1。

表1 各突變位點(diǎn)及引物信息表Table1 Primer information for each mutation sites

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最后獲得的復(fù)合擴(kuò)增體系可對(duì)所有20對(duì)突變位點(diǎn)成功擴(kuò)增，得到分型結(jié)果。對(duì)于正常樣本A，其野生組所有位點(diǎn)均可獲得分型峰，突變組所有位點(diǎn)均沒有分型峰，其復(fù)合熒光檢測(cè)體系結(jié)果分別見圖1。對(duì)于突變樣本B（以235delG突變型為例），其野生型除位點(diǎn)235delG不能獲得分型峰外，其余位點(diǎn)均可獲得相應(yīng)分型，而其突變組只有位點(diǎn)235delG能夠獲得分型峰，其余位點(diǎn)均無分型峰，其復(fù)合熒光檢測(cè)體系結(jié)果分別見圖2。

圖1 樣本A野生組（左）和突變組（右）復(fù)合熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.1 DNA profi les of wild type group （left） and mutation type group （right） for sample A

2.3 有效性驗(yàn)證

圖2 樣本B野生組（左）和突變型（右）復(fù)合熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.2 DNA profi les of wild type group （left） and mutation type group （right） for sample B

為了驗(yàn)證所構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系的有效性，從301醫(yī)院采集部分耳聾患者DNA樣本。使用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行驗(yàn)證。共檢測(cè)35份樣本，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，與已知信息一致。結(jié)果證明，使用該復(fù)合擴(kuò)增體系可有效檢測(cè)相應(yīng)的單基因遺傳病的基因型。

表2 抽樣樣本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table2 Test result of samples collected from a hospital

3 討 論

為適應(yīng)日益復(fù)雜的犯罪形勢(shì)，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)生物物證所能提供的信息進(jìn)行深入挖掘成為法醫(yī)遺傳學(xué)的研究重點(diǎn)。該研究主要包含三方面研究?jī)?nèi)容，分別是種族來源推斷研究，人類學(xué)、生理學(xué)特征（面貌、年齡等）推斷研究，以及病理特征推斷研究［6］。我國(guó)雖然是個(gè)多民族國(guó)家，但主要還是屬于東亞人種，只有位于歐、亞交界處的新疆維吾爾族、塔吉克族等民族屬于歐亞混合人種。目前雖然我國(guó)科學(xué)家也已建成較為成熟的種族推斷技術(shù)方法，可推斷大洲人群及典型的混合人群［7］，而人群進(jìn)一步細(xì)分技術(shù)，尚處于攻關(guān)階段。而外貌特征刻畫，國(guó)際上較為成熟的膚色、虹膜顏色、毛發(fā)顏色等的推斷技術(shù)［8］，也并不適用于國(guó)內(nèi)人群。本文首次嘗試對(duì)疾病特征進(jìn)行推斷，選取的三類遺傳病較為典型，均為單基因遺傳病，單位點(diǎn)的突變即可能致病，因此可檢測(cè)性強(qiáng)。同時(shí)，三類疾病表型特征明顯，一旦推測(cè)出檢材DNA帶有致病基因，即可對(duì)其相應(yīng)表型特征進(jìn)行大膽預(yù)測(cè)。本研究建立的檢測(cè)技術(shù)，所需儀器耗材均為普通法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室常用，無需另外配備，可推廣性較強(qiáng)。

在進(jìn)一步開展疾病特征推斷相關(guān)研究過程中，筆者認(rèn)為仍有許多問題及難點(diǎn)需待解決。第一，許多遺傳病為多基因遺傳，即使具備發(fā)病率較高，表型特征明顯等特點(diǎn)，但由于不屬于簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳，且缺乏充分的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)而導(dǎo)致直接進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用難度較大，如斑禿等；第二，公安系統(tǒng)開展此類研究，缺乏足夠的樣本數(shù)據(jù)支撐，難以從實(shí)際角度充分驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果；第三，對(duì)DNA供者可能持有的致病基因進(jìn)行檢測(cè)有可能涉及倫理問題，還有待進(jìn)一步討論?？傊?，疾病特征刻畫領(lǐng)域的研究工作，涉及面廣，但前景毋庸置疑。公安機(jī)關(guān)作為應(yīng)用部門，可充分加強(qiáng)與科研院所等基礎(chǔ)研究部門、醫(yī)院等樣本資源豐富的部門開展合作，協(xié)同創(chuàng)新，推動(dòng)該研究領(lǐng)域的深入發(fā)展。

［1］ 楊保勝.遺傳病與分子生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社， 2012.

［2］ Newton CR， Graham A， Heptinstall LE， et al.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system （ARMS） ［J］.Nucleic Acids Res， 1989，17（7）:2503-2516.

［3］ 胡華.芯片毛細(xì)管電泳基因突變檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的建立及其應(yīng)用研究［D］.重慶:第三軍醫(yī)大學(xué)，2008.

［4］ 李彩霞.一種全新基因突變檢測(cè)芯片的研究及在耳聾篩查中的應(yīng)用［D］.北京:清華大學(xué)，2007.

［5］ 譚昌淵.G6PD缺乏癥基因診斷新方法的建立［D］.上海:上海交通大學(xué)，2008.

［6］ 孫啟凡，趙蕾，江麗，等.DNA來源人特征刻畫的法庭科學(xué)應(yīng)用研究概況［J］.刑事技術(shù)，2015，40（3）:232-235.

［7］ Branicki W， Liu F， van Duijn K， et al.Model-based prediction of human hair color using DNA variants ［J］.Hum Genet，2011，129（4）:443-454.

［8］ Wei YL， Wei L， Zhao L， et al.A single tube 27-plex SNP assay for estimating individual ancestry and admixture from three continents ［J］.Int J Legal Med， 2015.［Epub ahead of print］

本文引用格式：孫啟凡， 趙蕾， 徐穎， 等.遺傳病推斷復(fù)合擴(kuò)增體系的構(gòu)建 ［J］.刑事技術(shù)， 2015，40（5）:364-367.

A Novel Multiplex PCR Assay for the Inference of Genetic Diseases

SUN Qifan1，2，3， ZHAO Lei1，2，3， XU Ying1，4， WANG Wei1，5， LONG Yuan1， MA Jiqiang1， WEI Yiliang6，7， ZHAO Xingchun1，2，3，YE Jian1，2，3， LI Caixia1，2，3，*
（1.Institute of Forensic Science， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination， Beijing 100038， China； 3.Key Laboratory of Forensic Genetics， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 4.National Police University of China， Shenyang 110854， China；5.Sh anxi Medical University， Taiyuan 030024， China； 6.Department of Biomedical Engineering， School of Medicine， Tsinghua University， Beijing 100084， China； 7.2011 Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics， Tianjin Medical University，Tianjin 300070， China）

Objective Genetic disease， usually controlled by pathogenic genes， occurs over mutation in the relevant genetic material.Theoretically， scientists can infer from the DNA typing whether a subject is prone to some kind of genetic diseases because of the regionality and/or inheritance of most these illnesses able to link the DNA donor with certain zone of the typed DNA.Therefore， the inference of unknown supplier of evidential substance， based on the information of some genetic diseases parsed with the relative DNA， may become an important research focus in forensic community due to the common fact that target suspects and/or any other clues are not easily exposed through the biologic samples collected from the scenes in criminal cases.Here， a simple and effi cient method was tried to establish for the detection of certain pathogenic genes.Methods Allele specifi c PCR （ASPCR） was conducted in two aliquots of each separately subjected to normal and mutant amplifi cation with the allele specific primers designed according to the sequenced gene， and followed by capillary electrophoresis for gene sequencing to get its genotype.Results A newly developed panel of 20 genes， synchronously detecting three kinds of genetic diseases based on allele specifi c PCR technique and capillary electrophoresis， were presented.The panel contained 11 disease genes of Genetic Deafness （one of the most common sensory disorders that affect communication）， 6 genetic loci of Beta Mediterranean anemia （of high incidence in China’s southern parts such as Guangdong， Guangxi and Hong Kong） and 3 loci of Glucose-6-phosphate dehydrogenase （G6PD） defi ciency （having its higher incidence in southern China， too）.Conclusions The multiplex assay， performed with PCR and the capillary electrophoresis available at most forensic genetic laboratories， is very likely to be a convenient and cost-effective choice for criminal investigations.

forensic genetics； allele specifi c PCR； capillary electrophoresis； genetic deafness；β-Mediterranean anemia；glucose-6-phosphate dehydrogenase defi ciency檢測(cè)的方法，運(yùn)用于法庭科學(xué)的DNA來源人特征刻畫領(lǐng)域，為案件偵查提供線索。方法 根據(jù)遺傳性耳聾、β-地中海貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥三類遺傳疾病各突變位點(diǎn)在中國(guó)人群中的出現(xiàn)概率，挑選了20個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，利用等位基因特異性PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建推斷這三類遺傳疾病的PCR檢測(cè)體系。結(jié)果構(gòu)建了包含20個(gè)突變位點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測(cè)遺傳性耳聾、地中海貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）三類遺傳疾病的毛細(xì)管電泳復(fù)合擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)體系。結(jié)論 在法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開展檢材DNA來源人的疾病特征推斷是可行的。通過進(jìn)一步研究發(fā)展，該技術(shù)有望在刑事案件偵查中發(fā)揮作用。

10.16467/j.1008-3650.2015.05.004

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2013GABJC037）

孫啟凡（1985—），女，山東棗莊人，主檢法醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: sunqifan@cifs.gov.cn

李彩霞，女，副主任法醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: licaixia@tsinghua.org.cn

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0364-04

2015-07-21