杜鵬瑞，杜　睿，路則棟，梁宗敏 （中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

西藏那曲地區(qū)夏季降水中生物冰核的分布特征

杜鵬瑞，杜睿*，路則棟，梁宗敏 （中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

于2013年6～10月在高海拔的西藏那曲地區(qū)采集雨水樣品，共獲得6月份和7月份兩個(gè)有效樣品.通過(guò)液滴凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，對(duì)雨水樣品中大于0.22μm的氣溶膠顆粒物的冰核活性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)不同處理（原樣雨水、濾液、添加蛋白變性劑、加熱煮沸）的雨水樣品的凍結(jié)溫度進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示，6月份和7月份原樣雨水樣品的平均凍結(jié)溫度分別為-13.3℃和-8.7℃.在-10℃以上，雨水樣品中存在對(duì)蛋白變性劑和加熱敏感的生物冰核，但不同月份雨水中的生物冰核對(duì)雨水液滴的凍結(jié)所起的貢獻(xiàn)不同.7月份雨水樣品中的高效生物冰核對(duì)液滴在較高溫度下凍結(jié)起到主要的催化作用，而6月份雨水樣品中的生物冰核對(duì)液滴凍結(jié)未起到顯著作用.經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾的雨水濾液樣品中，仍然存在高效生物冰核，但目前尚未確定其主要成分.通過(guò)對(duì)雨水樣品中細(xì)菌16S rRNA基因和真菌rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及5.8S rRNA的ITS1-5.8S-ITS2基因進(jìn)行克隆測(cè)序分析，獲得西藏那曲地區(qū)夏季6月份和7月份雨水樣品中細(xì)菌和真菌的群落組成.發(fā)現(xiàn)微生物群落組成中包含了具有高效生物冰核活性的假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌.

雨水；生物冰核；細(xì)菌；真菌；分布特征

青藏高原作為中國(guó)最大的高原，也是全球最高的高原，被譽(yù)為“世界屋脊”和“第三極”，經(jīng)全球熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的輸送，該地區(qū)的降雨和降雪的變化，會(huì)影響到全球大氣循環(huán)和水循環(huán)過(guò)程［1-2］.大氣中的氣溶膠粒子可以作為云凝結(jié)核（CCN）和冰核（IN）影響太陽(yáng)光的輻射以及云的形成［3-5］，進(jìn)而影響到降水過(guò)程.大氣和云層中的水汽和液態(tài)小水滴可通過(guò)同質(zhì)核化和異質(zhì)核化兩種途徑形成初始的冰晶.同質(zhì)核化以水分子構(gòu)成的集合體為中心，通常在溫度低于-35℃或 300%水汽過(guò)飽和度條件下才能凍結(jié)形成冰晶［6-7］.在真實(shí)大氣環(huán)境中，同質(zhì)核化并不容易發(fā)生.在溫度高于-35℃時(shí)，必須有冰核的存在，水汽和過(guò)冷液滴才更易形成冰晶［8-9］，即異質(zhì)核化.能作為冰核的主要?dú)馊苣z粒子有礦物沙塵［10-11］，煙塵［12］，結(jié)晶的鹽粒子［13-14］，以及生物粒子.而在這幾種冰核之中，生物氣溶膠粒子在較高溫度-2℃［15-16］下就能催化液滴形成冰晶，因此被認(rèn)為是自然界中最有效的冰核.

生物氣溶膠粒子包括細(xì)菌、真菌及其孢子、病毒、花粉以及動(dòng)植物殘片等.已有的研究表明，每年大約有 1000Tg的生物氣溶膠粒子進(jìn)入大氣［17］，細(xì)菌有0.4～28.1Tg，真菌有8～186Tg.細(xì)菌氣溶膠粒子的直徑在1μm左右，真菌氣溶膠粒子的直徑在 2～10μm［18］，這對(duì)于其作為冰核催化小液滴形成冰晶非常有利.目前，國(guó)內(nèi)外已分離出并得到普遍認(rèn)可的具有冰核活性的細(xì)菌主要分布于假單胞菌屬（Pseudomonas）、歐文氏菌屬（Erwinia）和黃單胞菌屬（Xanthomonas），具有冰核活性的真菌主要是鐮刀菌屬（Fusarium）真菌和一些共生的地衣真菌［15，19-22］.對(duì)于其他屬的細(xì)菌和真菌而言，基本不具備高效生物冰核活性.我國(guó)科研人員自20世紀(jì)80年代開(kāi)始對(duì)生物冰核的種類及其作用機(jī)理進(jìn)行研究，目前已經(jīng)從植物、昆蟲和土壤中分離出多株冰核活性細(xì)菌、真菌［21，23］.已有的研究多側(cè)重生物冰核對(duì)植物造成的霜凍災(zāi)害，以及利用其特性進(jìn)行促凍殺蟲和人工造雪，但對(duì)于生物冰核在大氣降水過(guò)程中的作用，則研究得相對(duì)較少［24-26］.

生物冰核是一類可以在-10℃以上較溫暖的條件下催化過(guò)冷卻水形成冰晶［27］的粒子.1957年法國(guó)氣象學(xué)家在云室實(shí)驗(yàn)中，首次發(fā)現(xiàn)霉菌孢子可以作為冰核催化液滴形成冰晶，之后 Schellt等［28］指出大氣中部分冰核可能是由生物引起的.自此，越來(lái)越多的生物冰核從大氣顆粒物、云滴和雪中分離出來(lái)［18，29］.在液滴凍結(jié)實(shí)驗(yàn)中，生物冰核使全部液滴凍結(jié)的平均溫度在-10℃以上，而已知的非生物高效冰核則在-10℃以下.但并非所有的生物氣溶膠粒子都可以作為生物冰核.已知的大多數(shù)細(xì)菌和真菌并不能在-10℃以上催化液滴凍結(jié)，因此不能被稱為生物冰核，而只能夠作為生物類的普通冰核存在于大氣中.即使已經(jīng)被證明具有冰核活性的細(xì)菌和真菌等生物冰核，由于菌體濃度和生長(zhǎng)環(huán)境等條件的影響，導(dǎo)致在-10℃以上不能催化液滴凍結(jié)，未能表現(xiàn)出生物冰核效應(yīng)［30-31］.科學(xué)家們已經(jīng)從云層、雨水和霜凍植物等眾多環(huán)境樣品中分離出生物冰核.一些學(xué)者認(rèn)為生物冰核分布廣泛，數(shù)量眾多，在大氣降水形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［29，32-35］，但也有學(xué)者對(duì)此持不同觀點(diǎn)，認(rèn)為生物冰核在降水過(guò)程中的作用非常微弱［36-37］.生物冰核高效的核化機(jī)制已經(jīng)被研究確認(rèn)：冰核生物含有冰核基因，其表達(dá)形成的冰核蛋白具有高效的成冰活性［38］.但由于無(wú)法確認(rèn)真實(shí)大氣環(huán)境中是否有足夠數(shù)量的生物冰核來(lái)激發(fā)催化冰晶的形成，使生物冰核在成云和降水過(guò)程中的貢獻(xiàn)大小成為了當(dāng)前生物氣溶膠研究中爭(zhēng)論的焦點(diǎn)之一.

國(guó)內(nèi)關(guān)于青藏高原地區(qū)降雪、凍土、冰芯以及其中的微生物群落多樣性與當(dāng)?shù)丨h(huán)境及氣候變化適應(yīng)關(guān)系的研究較多［39-42］，但尚未有關(guān)于生物冰核在當(dāng)?shù)亟邓^(guò)程中作用的研究.本研究通過(guò)對(duì)西藏那曲地區(qū)夏季雨水的液滴凍結(jié)溫度和其所含的冰核數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)雨水中的微生物群落組成進(jìn)行分析，以此來(lái)探究生物冰核在西藏夏季雨水中的分布特征和變化，進(jìn)而探討其在雨水形成過(guò)程中可能的貢獻(xiàn).

1　材料與方法

1.1采樣點(diǎn)介紹

降水樣品的采集地點(diǎn)位于中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測(cè)研究站.該站位于那曲縣羅馬鎮(zhèn)，地處唐古拉山脈與念青唐古拉山脈之間的那曲河流域，海拔4450m.該地區(qū)氣候類型為高原亞寒帶季風(fēng)半濕潤(rùn)氣候，下墊面為高寒草甸.年平均氣溫-2.1℃，全年降水大約400mm，多集中在6～9月，年平均相對(duì)濕度51%.

1.2降水樣品的采集與過(guò)濾

雨水樣品采集使用的是容積為3L的玻璃燒杯，為了增加接雨面積，專門制作了直徑為燒杯直徑2倍的不銹鋼接雨器，在接雨時(shí)加裝在燒杯口部.在降雨之前，用無(wú)菌去離子水對(duì)燒杯、不銹鋼接雨器以及過(guò)濾雨水時(shí)要用到的過(guò)濾裝置進(jìn)行充分清洗，然后包裹上醫(yī)用無(wú)紡布，在 121℃高溫條件下滅菌 20min.降雨開(kāi)始后，將多個(gè)加裝不銹鋼接雨器的玻璃燒杯置于空曠區(qū)域收集雨水.由于該地域空曠，常年大風(fēng)，為保障實(shí)驗(yàn)所需雨水量，雨水樣品是實(shí)驗(yàn)采樣月份中多次收集雨水的混合.每次收集樣品時(shí)間不超過(guò) 12h，所接雨水立即放入 4℃冰箱密封保存.降水樣品采集時(shí)間為2013年6～10月，但由于8月、9月和10月降水較少且受到大風(fēng)影響，收集的雨水不足以做相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因此只得到6月和7月兩個(gè)有效的雨水樣品，編號(hào)分別為XZ6和XZ7.采用真空抽濾泵（津騰公司）和硝酸纖維素膜（孔徑 0.22μm，直徑47mm，Millipore USA）對(duì)雨水樣品進(jìn)行過(guò)濾，每張濾膜過(guò)濾雨水量為500mL，每個(gè)月份的雨水樣品共過(guò)濾兩張濾膜.隨即將濾膜彎曲裝入無(wú)菌的50mL離心管中，保存于冰箱-20℃冷凍室，以備后續(xù)分析測(cè)試.另外，分別取原樣雨水和過(guò)濾后的雨水濾液裝入無(wú)菌的50mL離心管中，保存于4℃冰箱，以備后續(xù)分析.

1.3樣品處理

1.3.1雨水和濾膜上顆粒物的處理從-20℃冰箱中取出裝有硝酸纖維素濾膜的 50mL離心管，向其中加入滅菌的去離子水30mL，淹沒(méi)濾膜.用無(wú)菌玻璃棒輕劃濾膜，使其上面的顆粒物進(jìn)入去離子水中，再加入 20mL無(wú)菌去離子水到離心管中，蓋上蓋子后振蕩離心管，盡可能使膜上的所有顆粒物被重新洗入去離子水中.與原樣雨水相比，該處理使雨水中大于 0.22μm的顆粒物（過(guò)濾時(shí)被截流在濾膜上）的濃度提高了約 10倍.分別取3管原樣雨水（A1，A2，A3），3管過(guò)濾后的雨水濾液（B1，B2，B3），3管洗膜的雨水顆粒物重懸液（C1，C2，C3），每管10mL，分為A，B，C三組.分別向第二組樣品A2，B2，C2中加入200uL的苯酚+氯仿+異戊醇（比例為 25∶24∶1）的混合溶液，目的是使溶液中的蛋白質(zhì)變性.對(duì)第三組樣品A3，B3，C3進(jìn)行水浴加熱，在 100℃條件下水浴5min，使蛋白質(zhì)在高溫條件下變性失活.根據(jù)生物冰核的高效冰核活性來(lái)源于冰核蛋白的機(jī)理，樣品中所含的生物冰核經(jīng)上述兩種處理后會(huì)失去其部分或全部的高效核化活性.

1.3.2雨水中微生物 DNA的提取與測(cè)序從 -20℃冷凍室中取出濾膜，在超凈工作臺(tái)中用剪刀將濾膜剪碎，盛于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中.用無(wú)菌鑷子夾取剪碎的濾膜裝入 FastDNA SPIN Kit for soil（MP Biomedicals USA）提供的離心管中，然后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行微生物總 DNA的提取.DNA提取成功后，以DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因片斷.采用真菌通用引物ITS1f （5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），擴(kuò)增真菌rRNA上的ITS1-5.8S-ITS2基因片斷.PCR反應(yīng)條件及后續(xù)的克隆轉(zhuǎn)化與測(cè)序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)詳見(jiàn)文獻(xiàn)［43］.

1.4雨水中生物冰核的檢測(cè)

采用中國(guó)氣象科學(xué)研究院楊紹忠等［44-45］所研制的凍結(jié)核含量檢測(cè)裝置對(duì)雨水液滴的凍結(jié)溫度和雨水中的冰核數(shù)量進(jìn)行檢測(cè).按照裝置使用說(shuō)明，先用丙酮清洗實(shí)驗(yàn)臺(tái)上每個(gè)感應(yīng)件的表面，然后滴加憎水膠膜（防止不同組次實(shí)驗(yàn)的相互污染并維持一個(gè)相對(duì)干凈的本底），待其揮發(fā)蒸干后形成一個(gè)邊緣明顯的圓斑.使用移液槍在圓斑上滴加 10μL的小液滴，蓋上實(shí)驗(yàn)臺(tái)蓋子，按照2℃/min的速率進(jìn)行均勻降溫.從0℃開(kāi)始，傳感器和檢測(cè)器開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)，每有一個(gè)液滴凍結(jié)，就會(huì)記錄一個(gè)信號(hào)，最后會(huì)得出各個(gè)溫度下凍結(jié)液滴的個(gè)數(shù).每個(gè)樣品進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)試，使測(cè)試結(jié)果中的有效數(shù)據(jù)保持在200個(gè)以上，從而保障實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果的科學(xué)性.在對(duì)雨水各個(gè)處理樣品進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)，采用娃哈哈瓶裝純凈水作為對(duì)照，檢測(cè)其平均凍結(jié)溫度.

1.5數(shù)據(jù)處理

1.5.1冰核數(shù)據(jù)處理根據(jù)Vali［46］的研究，在每個(gè)溫度下凍結(jié)的液滴個(gè)數(shù)確定后，可以根據(jù)這些數(shù)據(jù)計(jì)算出測(cè)試樣品的平均凍結(jié)溫度以及每個(gè)溫度下累積的冰核數(shù).本文采用公式 K（θ）= ［ln（N0）-lnN（θ）］/V對(duì)雨水中各個(gè)溫度下累積冰核的濃度進(jìn)行計(jì)算.式中：K（θ）是待測(cè)溶液液滴中凍結(jié)核的累積濃度；N（θ）是當(dāng)溫度為θ時(shí)，待測(cè)液滴中尚未凍結(jié)的液滴數(shù)量；N0則是待測(cè)液滴的總數(shù)量；V是單個(gè)液滴的體積，cm3.

1.5.2測(cè)序數(shù)據(jù)處理測(cè)序得到 16S rRNA序列和ITS1-5.8S-ITS2序列，采用Mallard軟件對(duì)其中的嵌合體進(jìn)行檢測(cè)去除.剩余序列采用Mothur（www.mothur.org/）軟件，細(xì)菌按照相似性不小于 97%的序列劃分為同一個(gè) OTU （Operational Taxonomic Units）的原則進(jìn)行分類，真菌按照相似性不小于 99%的序列劃分為同一個(gè)OTU的原則進(jìn)行分類，同時(shí)給出每個(gè)OTU的代表序列和每個(gè)樣品（XZ6，XZ7）的群落多樣性指數(shù)（Shannon’s diversity indices，H），物種豐度（species richness，Chao1），稀有度曲線（rarefaction curves）與覆蓋率（coverage）.將得到的每一個(gè)OTU的代表序列放到 Genbank中的 NCBI Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，如果代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參比序列相似度達(dá)到97%以上，在分類學(xué)上就歸為同一個(gè)屬，因此可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中相似序列的種屬分類確定每個(gè)OTU中序列的分類歸屬.

2　結(jié)果與討論

2.1生物冰核檢測(cè)

根據(jù)生物冰核的定義［27］，以溫度高于-10℃時(shí)液滴凍結(jié)來(lái)判斷生物冰核的存在.兩個(gè)月份原樣雨水樣品 A1的平均凍結(jié)溫度分別是-13.3℃和-8.7℃（圖1）.因此可以確定7月份雨水樣品中存在生物冰核，且其在雨水液滴凍結(jié)中起到主要作用.雨水濾液樣品B1與A1相比，平均凍結(jié)溫度有微小降低.兩個(gè)月份 B1的平均凍結(jié)溫度分別是-14.4℃和-10.3℃.作為對(duì)照的娃哈哈瓶裝純凈水的平均凍結(jié)溫度為-17.5℃和-17.7℃，低于濾液B1.濾液B1是A1經(jīng)過(guò)0.22μm的硝酸纖維素濾膜過(guò)濾得到的，其中的生物與非生物冰核都有所減少，但7月份雨水濾液樣品B1的平均凍結(jié)溫度依然接近-10℃，遠(yuǎn)高于純凈水的-17℃.由于生物冰核能在較高溫度下催化液滴凍結(jié)的機(jī)理［38，47-51］是其具有冰核基因，冰核基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工后，在細(xì)胞膜表面形成具有一定結(jié)構(gòu)的冰核蛋白［50，52-53］，因此7月份濾液B1的平均凍結(jié)溫度接近-10℃，可能是因?yàn)檫^(guò)濾過(guò)程中一部分冰核蛋白脫離菌體進(jìn)入濾液或?yàn)V液中含有類似于冰核蛋白且具有高效核化活性的未知物質(zhì).洗膜的顆粒物懸浮液C1與A1相比，平均凍結(jié)溫度提高到-9.4℃和-8.0℃，顯示雨水顆粒物中的確存在高效冰核.生物冰核效應(yīng)與生物冰核的濃度有很大的關(guān)系［30］，只有生物冰核達(dá)到一定濃度后，才能使液滴的平均凍結(jié)溫度達(dá)到-10℃以上.C1處理對(duì)雨水中大于0.22μm的顆粒物濃度進(jìn)行了10倍左右的濃縮，同時(shí)已知的非生物冰核使液滴凍結(jié)的平均溫度均在-10℃以下，因此凍結(jié)溫度的顯著增高可能是生物冰核濃度增加引起的.大氣中的微生物一般多黏附在顆粒物表面，雨水中大于 0.22μm的顆粒物的濃度提高，會(huì)使生物冰核的濃度同時(shí)得到提高，從而生物冰核效應(yīng)增強(qiáng)，液滴的平均凍結(jié)溫度升高.楊紹忠等［44］采用相同的凍結(jié)核檢測(cè)裝置，測(cè)得北京地區(qū)的冰雹融化水和雨水的平均凍結(jié)溫度在-12.1℃到-16.17℃，其結(jié)果與本研究 6月份雨水樣品的平均凍結(jié)溫度接近，但明顯與低于7月份雨水的平均凍結(jié)溫度.王亞玲等［30］采用 Pseudomonas syingae冰核細(xì)菌菌懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，菌液濃度高于105cells/mL時(shí)，液滴的平均凍結(jié)溫度高達(dá)-5℃，但菌液濃度降低時(shí)，其平均凍結(jié)溫度明顯降低，低于-10℃.6月份雨水樣品A1與C1的差異，就是由于生物冰核濃度的不同引起的.

添加蛋白變性劑（苯酚、氯仿、異戊醇混合液）的第二組樣品 A2，B2，C2和加熱煮沸處理的第三組樣品A3，B3，C3中的冰核蛋白因蛋白變性劑和受熱發(fā)生變性，從而抑制生物冰核的核化活性，與未做相應(yīng)處理的樣品相比，加入蛋白變性劑和加熱煮沸降低了液滴的平均凍結(jié)溫度.由于非生物類冰核對(duì)蛋白變性劑和加熱不敏感，因此西藏夏季雨水樣品中一定存在生物冰核.當(dāng)它們經(jīng)過(guò)蛋白變性劑和加熱處理后，其核化活性受到破壞或者抑制，造成了液滴平均凍結(jié)溫度的降低.與雨水樣品 C1相比，進(jìn)行蛋白變性處理的雨水樣品C2，C3的液滴平均凍結(jié)溫度降低了0.3～3.3℃，但均高于做相同蛋白變性處理的雨水樣品A2，A3的平均凍結(jié)溫度.這可能是因?yàn)榈鞍鬃冃詣┖图訜崽幚聿⑽赐耆种粕锉说幕钚?表1給出了蛋白變性劑和加熱煮沸處理對(duì)生物冰核的破壞程度.7月份雨水樣品C2，C3的平均凍結(jié)溫度依然在-10℃以上，6月份雨水樣品中的C2的平均凍結(jié)溫度也接近-10℃，這再次表明經(jīng)處理后部分生物冰核仍保持活性.

圖1　不同處理的雨水樣品的平均凍結(jié)溫度Fig.1　Average freezing temperatures of rain water under different treatments

圖2顯示，當(dāng)溫度降到-10℃時(shí)，不同處理樣品測(cè)試液滴中所檢測(cè)到的累積冰核數(shù)目.假定在這個(gè)溫度下累積的冰核都是生物冰核，則兩個(gè)月份的原樣雨水樣品 A1中都存在生物冰核，但它們的平均凍結(jié)溫度卻存在較大的差異，6月份為-13.3℃，在-10℃以下，7月份為-8.7℃，在-10℃以上.這是因?yàn)?月份雨水樣品中所含生物冰核數(shù)量較少，對(duì)浸潤(rùn)模式下液滴的全部?jī)鼋Y(jié)所起的作用不大.7月份雨水樣品中含有大量的生物冰核，液滴凍結(jié)主要由其催化引起.這也證明了由于生物冰核濃度大小的差異，使得生物氣溶膠在大氣降雨過(guò)程中的貢獻(xiàn)存在較多的不確定性.由表 1可知，除7月份雨水顆粒物濃縮樣品的加熱處理C3外，其他測(cè)試樣品的加熱處理都使生物冰核在-10℃的累積量減少 85%以上.蛋白變性劑對(duì)生物冰核的影響差異較大.在-10℃條件下，生物冰核的減少量在3.44%到87.05%之間變化.

值得注意的是，與雨水樣品B1相比，雨水樣品B2和B3的平均凍結(jié)溫度以及在-10℃累積的冰核數(shù)目都有所降低.7月份雨水樣品中的B3比 B1的平均凍結(jié)溫度降低了4.6℃，6月份雨水樣品中的 B3在-10℃累積的冰核數(shù)目比B1減少了100%.由于經(jīng)過(guò)孔徑為 0.22um的硝酸纖維素膜過(guò)濾，B1中含有完整的且具有高效冰核活性的細(xì)菌和真菌的比例很低，但其在-10℃以上仍顯示有冰核的存在.加入蛋白變性劑和加熱煮沸處理后，B2和B3在-10℃的冰核數(shù)減少.因此，可以推測(cè)濾液B1中對(duì)蛋白變性劑和加熱煮沸處理敏感的冰核具有一定的生物活性，它或是冰核蛋白及其殘片，或是病毒，亦或是目前還未認(rèn)知的某種新的生物冰核. Christner等［29，32］分別采用蛋白酶及加熱處理對(duì)雨水和雪水中的生物冰核進(jìn)行處理，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入蛋白酶破壞冰核蛋白后，各樣品在-9℃以上累積冰核的減少量在25%～64%，而進(jìn)行加熱處理使蛋白變性后，各樣品在-9℃累積冰核的減少量在 69%～100%，這與本研究結(jié)果基本類似.

圖2　在溫度-10℃時(shí)的累積冰核數(shù)Fig.2　Cumulative number of Ice Nuclei at the temperature of -10℃

綜合以上結(jié)果，同時(shí)根據(jù)生物冰核的定義，可以認(rèn)定那曲地區(qū)夏季降雨中確實(shí)存在生物冰核，但這部分生物冰核是來(lái)自于降水形成過(guò)程中的云內(nèi)清除還是來(lái)自于云下清除尚不確定.如果來(lái)自于云內(nèi)清除過(guò)程，生物冰核就可能在降水的形成過(guò)程中起到一定的作用，但如果來(lái)自于云下清除過(guò)程，則無(wú)法確定其在降水形成過(guò)程中的影響，另外一種可能則是兩種過(guò)程并存.

表1　蛋白變性劑和加熱煮沸對(duì)生物冰核活性的影響（%）Table 1　The effects of Protein Denaturants and Boiling on the activities of Biological Ice Nuclei （%）

表2　克隆文庫(kù)各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)估Table 2　Assessment for indicators of the clone libraries

2.2測(cè)序基因文庫(kù)指標(biāo)分析

對(duì)雨水中微生物的基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去雜、去嵌合體后，細(xì)菌16S rRNA基因序列構(gòu)成的克隆文庫(kù)為：XZB6（56個(gè)有效克隆子），XZB7（129個(gè)有效克隆子），真菌 ITS1-5.8S-ITS2基因序列構(gòu)成的克隆文庫(kù)為：XZF6（59個(gè)有效克隆子），XZF7（66個(gè)有效克隆子）.表2給出4個(gè)克隆文庫(kù)的基本指標(biāo)數(shù)據(jù)，樣品測(cè)序結(jié)果的覆蓋率在77%～92%，已能夠覆蓋樣品中主要的細(xì)菌和真菌種群.7月份雨水中細(xì)菌的物種豐度（Chao1指數(shù)）是6月份雨水中的4倍，7月份雨水中真菌的物種豐度是6月份雨水中的2倍左右，由此可見(jiàn)，西藏6月份與7月份的雨水樣品中物種數(shù)目存在較大差異，7月份雨水中的細(xì)菌和真菌物種數(shù)明顯高于 6月份雨水.兩個(gè)月份中，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）差異不大，但真菌的群落多樣性指數(shù)有明顯的差異，這與群落中物種的數(shù)目和每個(gè)物種所占比例有關(guān)，6月份雨水中的真菌大多屬于同一類.由于大氣中的微生物主要來(lái)自于地面植被、土壤和人為的排放，因此以上群落的差異可能是由于降雨前人為活動(dòng)（如放牧）或自然活動(dòng)（風(fēng)）的影響，也可能是由于地面植被不同生長(zhǎng)階段的變化.另外，降雨形成過(guò)程涉及到大氣循環(huán)以及其中物質(zhì)的傳輸與變化，這也會(huì)引起群落組成的差異

2.3群落結(jié)構(gòu)組成

2.3.1細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析將克隆文庫(kù)中每個(gè)OTU的代表序列放入NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)的結(jié)果顯示，共得到14個(gè)屬的細(xì)菌（圖3）.6月份雨水樣品中的細(xì)菌主要屬于變形菌門和放線菌門，分別占89.3%和8.9%.7月份雨水樣品中的細(xì)菌包括三個(gè)門，所占比例分別為變形菌門占58.1%，放線菌門占3.8%，厚壁菌門占32.5%.兩個(gè)月份的雨水樣品中，有一種共同的優(yōu)勢(shì)屬細(xì)菌，即β變形菌綱的 Massilia屬，它在兩個(gè)月份中的比例分別為37.2%和67.8%.另外，6月份雨水樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬還有γ變形菌綱的Acinetobacter屬（12.5%）和放線菌門的Arthrobacter屬（8.9%）.7月份雨水樣品中的優(yōu)勢(shì)屬還有 β變形菌綱的 Variovorax屬（7.8%）和厚壁菌門的Exiguobacterium屬（32.6%）.與生物冰核相關(guān)的Pseudomonas屬細(xì)菌卻僅在6月份的雨水樣品中發(fā)現(xiàn)，而且所占比例非常低，僅占細(xì)菌克隆總數(shù)的1.8%.

2.3.2真菌群落結(jié)構(gòu)分析圖4顯示，6月份雨水樣品中能明確分類到屬的真菌僅有兩種，分別是擔(dān)子菌門的隱球菌屬（Cryptococcus）和子囊菌門的短梗霉屬（Aureobasidium），隱球菌屬占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，所占比例為94.9%. 7月份雨水樣品中的真菌種類相對(duì)豐富，共有9個(gè)屬的真菌被確定出來(lái)，分別為子囊菌門的莖點(diǎn)霉屬（Phoma），地絲菌屬（Geomyces），德巴利氏酵母屬（Fusarium），鐮刀菌 屬（Fusarium），擔(dān)子菌 門的鬼傘 屬（Coprinopsis），白冬孢酵母屬（Leucosporidium），隱球菌屬（Cryptococcus），黑粉菌屬（Ustilago），另外還鑒定出一種非真菌門類而屬于綠藻門的蕨藻屬（Caulerpa）.隱球菌屬（Cryptococcus）真菌在 7月份的雨水樣品中依然屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，但所占比例降低到 36.4%.另一種地絲菌屬（Geomyces）真菌比它更加豐富，所占比例是 45.5%.在兩個(gè)月份的雨水樣品中，僅在7月份發(fā)現(xiàn)與生物冰核相關(guān)的鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，所占比例為3.0%.

圖3　細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成（屬水平）Fig.3　Bacterial community structures （the level of genus）

2.3.3與其他生境條件微生物群落組成的比較同一個(gè)地區(qū)，不同生境條件下，微生物的群落組成會(huì)有不同，這些差異能夠反應(yīng)出不同生境的獨(dú)特環(huán)境條件以及功能.青藏高原地區(qū)降水中的微生物群落組成與本地區(qū)的冰川、湖泊、土壤中的微生物群落組成存在一定的相似性和差異性.在門的分類水平上，青藏高原地區(qū)廣泛存在放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的細(xì)菌［54-57］，不同生境的相似性較高，但在屬水平上的差異卻很明顯.例如，那木錯(cuò)湖水中的Hydrogenophaga屬細(xì)菌占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)［55］，而在雪樣中，Sphingomonas屬和Polaromonas屬細(xì)菌較為常見(jiàn)［56］.雖然雨水中的各屬細(xì)菌在青藏高原其他生境中均有所發(fā)現(xiàn)，但在群落組成和優(yōu)勢(shì)物種等方面的差異仍然較大［56，58-59］.土壤、湖泊以及積雪中的微生物與當(dāng)?shù)丨h(huán)境的關(guān)系非常緊密，所反映出的變化趨勢(shì)更側(cè)重長(zhǎng)期效應(yīng)，而本研究采集的降水樣品中的微生物可能是隨著大氣環(huán)流從其他地方輸送而來(lái)，也有可能再次被輸送到其它區(qū)域.因此降水中微生物的組成很可能與當(dāng)?shù)仄渌h(huán)境中微生物群落存在較大的差異.

2.4微生物群落組成與液滴凍結(jié)的關(guān)系

6月份和7月份雨水樣品中的微生物群落組成表明，6月份雨水樣品中存在與生物冰核相關(guān)的假單胞菌屬（Pseudomona）細(xì)菌，7月份雨水樣品中存在與生物冰核相關(guān)的鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，但兩者在群落中所占的比例都較低.除上述兩種生物冰核外，尚未發(fā)現(xiàn)其它已得到公認(rèn)的生物冰核種類.根據(jù)液滴凍結(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，蛋白變性劑和加熱處理使雨水原液A1在-10℃累積冰核數(shù)減少，因此我們確定兩次雨水樣品中都存在生物冰核.但其對(duì)全部液滴的凍結(jié)所起的作用有所差異，7月份A1的平均凍結(jié)溫度為-8.7℃，生物冰核在雨水液滴凍結(jié)中起主要作用，6月份雨水液滴凍結(jié)平均溫度為-13.3℃，凍結(jié)過(guò)程中起主要作用的是非生物冰核.本研究中使用的克隆測(cè)序技術(shù)能夠分析得出優(yōu)勢(shì)菌群，當(dāng)生物冰核在大氣環(huán)境中不占優(yōu)勢(shì)時(shí)，可能檢測(cè)不到全部種類的冰核生物.此外，冰核細(xì)菌不同變種之間的冰核活性存在較大差異，很難根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)在種水平上對(duì)細(xì)菌、真菌等生物冰核進(jìn)行鑒定.即使鑒定出具有冰核活性的細(xì)菌種類，因其冰核活性的表達(dá)受到許多外界條件的制約，只有滿足這些條件，比如需要低溫誘導(dǎo)冰核蛋白的表達(dá)，需要一定的生物冰核濃度等，才能在-10℃以上起到冰核催化作用.因此，在研究生物冰核的分布及其作用時(shí)，可以通過(guò)測(cè)序或培養(yǎng)的方法尋找具有生物冰核活性的微生物，但更重要的是通過(guò)凍結(jié)溫度的測(cè)試來(lái)鑒定生物冰核的存在及其作用強(qiáng)度.

3　結(jié)論

3.1西藏那曲地區(qū)，夏季6月份和7月份的雨水樣品中都存在生物冰核.6月份原樣雨水中生物冰核的量較少，在全部液滴凍結(jié)中未起到主要作用.7月份原樣雨水中生物冰核的量較大，對(duì)全部液滴凍結(jié)起到了主要作用.

3.2西藏那曲地區(qū)夏季不同月份雨水中生物群落組成存在差異.兩個(gè)月份的雨水中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)門類14個(gè)屬的細(xì)菌，3個(gè)門類10個(gè)屬的真菌.夏季雨水樣品中發(fā)現(xiàn)含有生物冰核的假單胞菌屬（Pseudomona）細(xì)菌和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌.雨水液滴凍結(jié)檢測(cè)結(jié)果顯示，雨水中的生物氣溶膠具有一定的高效冰核活性.

3.3經(jīng) 0.22μm過(guò)濾得到的雨水濾液中依然存在生物冰核，但其成分尚未得到確定，還需在以后的研究中進(jìn)一步探明其屬性.

3.4雨水中檢測(cè)到的生物冰核來(lái)自于云內(nèi)清除還是云下清除存在不確定性，生物冰核在大氣降水形成過(guò)程中所做貢獻(xiàn)的大小還有待商榷.

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致謝：真誠(chéng)感謝中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測(cè)研究站的全體工作人員在采樣過(guò)程中所提供的幫助.

Distribution of biological ice nuclei in the summer precipitations of Naqu in Tibet.

DU Peng-rui，DU Rui*，LU Ze-dong，LIANG Zong-min （College of Resource and Environment，University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）.

China Environmental Science，2015，35（7）：1998～2006

Precipitation sampling was took at Naqu of Tibet from June to October，2013. Only two valid rainwater samples in June and July were got. With the experiments of droplets freezing，the average frozen temperature of droplets embedded with particulate matters （＞0.22μm） of rainwater samples were tested. Meanwhile，the activity of ice nuclei in the original rainwater，filtered rainwater，rainwater added with protein denaturants，boiled rainwater had also been tested. The results indicated that the average freezing temperatures of original rainwater droplets in June and July were -13.3℃and -8.7℃，respectively. As for samples with the average freezing temperatures above -10℃，it can be concluded that there were some biological ice nuclei in the original rainwater，which were sensitive to the protein denaturants and boiling. However，their nucleation activities were different for these two months. The biological ice nuclei played a major role in the freezing of droplets in July，but not in the June. The filtered rainwater still contained efficient biological ice nuclei，but the compositions were still unknown. Using the cloning and sequencing technology，the bacteria 16S rRNA gene and the fungi ITS1-5.8S-ITS2 gene that covered the two internal transcribed spacer and 5.8S rRNA gene were analyzed. The results indicated that the bacterial genus of Pseudomonas and the fungal genus of Fusarium were recovered in the rainwater and they were supposed to be two types of efficient biological ice nuclei.

rainwater；biological ice nuclei；bacteria；fungi；distribution

X172

A

1000-6293（2015）07-1998-09

2014-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41175135）

* 責(zé)任作者，副教授，ruidu@ucas.ac.cn

杜鵬瑞（1988-），男，河南鄭州人，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)博士研究生，主要從事生物氣溶膠研究.