王增武

[摘要]目的觀察β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)，探討其在膿毒癥心肌損傷中的作用。方法采用腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS）制作膿毒癥模型，在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采用左心室插管術(shù)測(cè)量心功能參數(shù)，留取心臟組織分別用免疫印跡（Western Blot）、免疫組化（IHC）檢測(cè)β3整合素的表達(dá)以及HE染色、天狼猩紅染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果心功能參數(shù)的改變主要發(fā)生在膿毒癥早期，即左心室舒張壓、左心室發(fā)展壓、左心室壓力上升的最大變化速率、左心室壓力下降的最大變化速率、心肌耗氧指數(shù)與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），組織形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織細(xì)胞空泡變性，排列松散，結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)膠原纖維數(shù)量減少。Western Blot和IHC結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組β3整合素與對(duì)照組比較降低，且6h后較顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）。結(jié)論在膿毒癥心肌損傷的過程中，β3整合素表達(dá)改變顯著，其可能參與了膿毒癥心肌損傷的機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]膿毒癥；心肌損傷；β3整合素

中圖分類號(hào)：R631文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009_816X（2015）04_0274_04

doi：103969/jissn1009_816x20150403Study of the Effects of β3 Integrin in Sepsis Induced Myocardial Injury in Rats. LU Yun_yan， YAN Jing. First People's Hospital of Xiaoshan， Zhejiang 311200， China

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes of changes of expression changes of expressionβ3 integrin in septic rat hearts and its roles in sepsis induced myocardial injury. Methods Sprague_Dawle rats in experimental group were injected Escherichia coli endotoxin （LPS）. At the corresponding time of points， the hearts were isolated for morphologic pathology and sirius red staining， and cardiac functions， including left ventricular developed pressure （LVDP）， left ventricular pressure maximal rate of rise （+dP/dtmax）， left ventricular pressure the maximum rate of descent （-dP/dtmax）， myocardial oxygen consumption index （SPTI*HR） and left ventricular end diastolic pressure （LVEDP） were measured using left ventricular catheterization. The expression of β3 integrin in myocardium were measured using western blotting and immunohistochemistry. Results Hemodynamic changes occurred in the early stage of sepsis. LVDP， +dP/dtmax， -dP/dtmax， SPTI*HR in experimental group decreased significantly， compared with those in control group （P<0.05）. Histopathology of the hearts in LPS group showed vacuolar degeneration， arrangement in loose， structural disorder， interstitial collagen fibers decreased. Western Blot and IHC showed that β3 integrin expression decreased in experimental group， especially 6h after LPS injection（P<0.01）. Conclusions There were significant structural and functional changes in sepsis_induced myocardial injury and β3 integrin involved in the mechanisms of myocardial injury in sepsis rats.

[Key words] Sepsis； Myocardial injury； Beta3 integrin

膿毒癥（Sepsis）是目前ICU中的首要死亡原因。40%～50%膿毒癥患者合并心功能不全，研究表明膿毒癥患者伴心功能不全死亡率（70%）與不伴心功能不全（20%）比較明顯升高[1]。整合素是由α和β亞基通過非共價(jià)鍵組成的異二聚體，廣泛分布于細(xì)胞表面，是細(xì)胞表面一類重要的兼具粘附和信號(hào)傳導(dǎo)功能的受體[2]。其參與了正常心臟發(fā)育和某些心臟疾病如心肌肥厚、擴(kuò)張性心肌病和心肌梗死等的發(fā)生過程[3]，但其是否參與膿毒癥心肌損傷的機(jī)制尚不清楚。本研究觀察膿毒癥大鼠心肌組織β3整合素表達(dá)與膿毒癥大鼠心功能參數(shù)的變化，探討膿毒癥導(dǎo)致心肌損傷的相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8至10周、清潔級(jí)、雄性SD大鼠90只，體重200～250g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（2011年10月）。室溫飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)分配原則分成9組。（1）實(shí)驗(yàn)組（LPS組）：采用腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS）5mg/kg制作膿毒癥模型，其中實(shí)驗(yàn)組按LPS作用時(shí)間分成8個(gè)亞組：1小時(shí)組（LPS 1h），2小時(shí)組（LPS 2h），4小時(shí)組（LPS 4h），6小時(shí)組（LPS 6h），12小時(shí)組（LPS 12h），18小時(shí)組（LPS 18h），24小時(shí)組（LPS 24h），48小時(shí)組（LPS 48h），各組均為10只。（2）對(duì)照組（NS組）：腹腔注射09%氯化鈉注射液（5ml/kg），共10只。

12實(shí)驗(yàn)方法：

121心功能參數(shù)測(cè)定：采用改良的左心室插管術(shù)[4]檢測(cè)大鼠心功能參數(shù)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠以腹腔注射10%烏拉坦（10ml/kg）麻醉并固定，頸部正中切口，分離出右頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈導(dǎo)管沿右頸總動(dòng)脈在壓力波形的指導(dǎo)下插入左心室，測(cè)量左心室舒張壓（LVEDP）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室壓力上升的最大變化速率（+dP/dtmax）、左心室壓力下降的最大變化速率（-dP/dtmax）、心肌耗氧指數(shù)（SPTI*HR）等指標(biāo)。采用上海奧爾科特生物科技有限公司MPA心功能分析系統(tǒng)記錄和分析。

122心臟樣本采集：所有大鼠在心功能監(jiān)測(cè)完畢后，常規(guī)消毒，腹正中切開，鈍性分離，摘取心臟，取小部分新鮮的心肌組織置于液氮中保存用于Western Blot測(cè)定，余下的置于10%甲醛溶液中固定做HE染色及免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)。

123HE染色：光鏡觀察大鼠心肌組織的病理形態(tài)。各組心肌組織塊置入10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木素染色、封片。

124苦味酸天狼猩紅染色：切片脫蠟、蒸餾水洗、苦味酸天狼紅染液染30～60min、無水酒精直接分化與脫水、二甲苯透明，封片。

125免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)心肌組織中β3整合素：用液氮研磨新鮮的大鼠心肌組織，加入裂解液，在冰上孵育半小時(shí)后4℃離心機(jī)后提取上清液為蛋白液，采用BCA法測(cè)定蛋白水平。根據(jù)樣品水平，吸取20ug蛋白上樣（稀釋成20ul），用6%SDS_PACE（SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺）凝膠電泳，取出凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn)膜（100V 15h），把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，經(jīng)過封閉、清洗，加一抗（1：1500）4℃過夜孵育，沖洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光儀顯影。

126免疫組化（IHC）檢測(cè)心肌組織中β3整合素：將石蠟脫水化和抗原熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，一抗4℃過夜孵育，沖洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育（37℃，05h），以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素襯染，然后常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢觀察結(jié)果，呈棕黃色者判為陽性。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS170統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21心功能變化：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、SPTI*HR較對(duì)照組（NS組）顯著降低，其中1h、2h、4h、6h下降明顯；而LVEDP則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），見表1。表1心功能參數(shù)變化（x-±s）

組別（n=10）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmax（mmHg/s）SPTI*HR（mmHg*s*bpm）對(duì)照組NS16184±2803-1541±382615848±45133-567138±70265402537±49964實(shí)驗(yàn)組LPS_1h11707±1392*-231±539*418442±34945*-361402±46023*313105±25610*LPS_2h11273±1115*-061±165*396177±34445*-330171±42415*270522±93201*LPS_4h12448±1578*-2019±622516089±43715*-456751±120371232879±55680*LPS_6h12832±1826*-1465±662518572±33696*-509908±73444290733±43647*LPS_12h17019±2031-2037±318654288±26910〖〗-610782±71625364788±15801LPS_18h17689±508-1931±090721011±15247*-627860±23558252362±39016*LPS_24h15822±3537-1367±360619572±23410〖〗-613823±11855307237±57040*LPS_48h14405±2930-981±324565045±23410-493864±116074399480±73360P<001<001<001<001<001F5542004595369573注：與對(duì)照組比較P<00522光鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化：

221HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)的變化：對(duì)照組大鼠心肌組織光鏡下可見心肌細(xì)胞為短柱狀的肌纖維，胞核較粗大，肌纖維呈束狀分布；間質(zhì)纖維細(xì)胞呈梭形，分布在心肌束的外緣或突向心肌間質(zhì)，胞核細(xì)長。實(shí)驗(yàn)組，LPS 6h時(shí)未見明顯的形態(tài)變化，偶見輕度水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，LPS 12h后可見心肌細(xì)胞腫脹、灶性心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞可見空泡變性、心肌細(xì)胞排列松散，結(jié)構(gòu)紊亂，見圖1。圖1大鼠心肌組織病理學(xué)觀察（HE，×400）

222苦味酸天狼猩紅染色觀察心肌間質(zhì)纖維組織的變化：對(duì)照組大鼠心肌組織經(jīng)苦味酸天狼猩紅染色，普通光鏡下心肌肌纖維呈淡黃色，心肌間質(zhì)的膠原纖維呈猩紅色。對(duì)照組心肌組織光鏡下可見猩紅色膠原纖維包圍在心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞周圍排列較整齊。實(shí)驗(yàn)組猩紅色膠原纖維與對(duì)照組相比排列紊亂，其膠原纖維在心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞周圍的數(shù)量明顯減少，見圖2。圖2大鼠心肌組織病理學(xué)觀察（天狼猩紅染色，×200）

23β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)變化：

231Western Blot檢測(cè)β3整合素蛋白表達(dá)：β3整合素實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較蛋白條帶顏色變淡，說明其表達(dá)降低（實(shí)驗(yàn)中均以β_actin為內(nèi)參作為對(duì)照），且在LPS 6h、LPS 12h、LPS 18h、LPS 24h、LPS 48h實(shí)驗(yàn)組條帶顏色明顯變淡，說明其表達(dá)顯著下降，見圖3。

圖3Western Blot檢測(cè)大鼠心肌組織β3整合素蛋白條帶

232免疫組化檢測(cè)大鼠心肌組織中β3整合素表達(dá)：以對(duì)照組（NS組）加PBS做陰性對(duì)照（NS_PBS），觀察結(jié)果：β3整合素的表達(dá)主要在心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞，與陰性對(duì)照相比其陽性表現(xiàn)是細(xì)胞胞漿染色呈均質(zhì)淡棕黃色。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較其胞漿棕黃色顏色明顯變淺，說明在β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)降低，見圖4。圖4大鼠心肌組織β3整合素表達(dá)（×200）3討論

本研究應(yīng)用大鼠腹腔注射LPS的方法制作膿毒癥動(dòng)物模型，分別在不同的作用時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)大鼠心臟功能及組織結(jié)構(gòu)的改變以及心肌組織中β3整合素的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膿毒癥發(fā)生早期大鼠即發(fā)生心功能的變化，而心臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化則出現(xiàn)較晚，通過Western blot及IHC發(fā)現(xiàn)心肌組織中β3整合素的改變主要發(fā)生在LPS注射6h之后的實(shí)驗(yàn)組，說明β3整合素的改變與心臟組織結(jié)構(gòu)的變化存在密切關(guān)系。

目前膿毒癥心肌損傷的機(jī)制尚不明確，認(rèn)為主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞因子對(duì)心肌的損傷（TNF_α、IL_1β、IL_6）；一氧化氮的影響；缺血-再灌注和氧自由基損傷；心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡；能量代謝異常；心肌局部腎素-血管緊張素RAS系統(tǒng)的過度激活等，而近年來心肌凋亡途徑參與膿毒癥心肌損傷的機(jī)制也受到重視[5]。

本文應(yīng)用Western blot和免疫組化檢測(cè)膿毒癥大鼠心肌組織中β3整合素的表達(dá)變化，結(jié)果顯示心肌組織中β3整合素在LPS作用6h后與對(duì)照組相比較表現(xiàn)為顯著性的下降（灰度值比較P<001），推測(cè)β3整合素在膿毒癥心肌損傷中發(fā)生了顯著改變，分析其可能與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)顯著性改變、細(xì)胞凋亡、血小板活化等因素相關(guān)。

心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)顯著性改變是膿毒癥心肌損傷的重要機(jī)制之一，研究表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載在心肌缺血-再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中起中心作用[6]。整合素受體中的αIIbβ3、αvβ6、αvβ5、α5β1 及α5β3都曾被發(fā)現(xiàn)與Ca2+電流信號(hào)有關(guān)，它們可以介導(dǎo)細(xì)胞與纖維連接蛋白之間的連接，短暫激活p42/p44 MARK通路，增加心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度[7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)用β3整合素基因敲除的老鼠中研究證明β3整合素介導(dǎo)Pyk2途徑在導(dǎo)致心臟纖維化中起到關(guān)鍵作用[8]。在本研究膿毒癥心肌損傷中，整合素受體與鈣離子濃度相關(guān)的β3整合素的表達(dá)異常，說明其可能參與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度失衡機(jī)制，使心肌收縮和舒張功能受到抑制，最終導(dǎo)致心力衰竭。

在膿毒癥心肌損傷的機(jī)制中兩條細(xì)胞凋亡途徑已經(jīng)被確認(rèn)：第一是腫瘤壞死因子受體（TRADD）相關(guān)激活第一途徑（外源性凋亡級(jí)聯(lián)）；第二個(gè)途徑由外源應(yīng)力引起的刺激激活的凋亡機(jī)制。在多種動(dòng)物模型中觀察到αvβ3抑制劑可通過激活半胱天冬酶8（Caspase 8）依賴凋亡通路及增強(qiáng)腫瘤抑制因子p56活性、降低抗凋亡蛋白Bax水平，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制血管、腫瘤生長[9]。在本研究中發(fā)現(xiàn)β3整合素在膿毒癥晚期表達(dá)顯著性下降，分析其可能促使細(xì)胞凋亡機(jī)制紊亂，激活相關(guān)凋亡途徑，使心肌病理凋亡過程加速，從而導(dǎo)致膿毒癥心肌損傷后心力衰竭的發(fā)生。

另外，整合素αIIbβ3主要表達(dá)于巨核細(xì)胞和血小板表面，是血小板膜的主要受體，并且它的活化被視作血小板活化及血栓形成的最終共同通路。當(dāng)整合素αIIbβ3表達(dá)異?；蛉毕輹r(shí)，可能導(dǎo)致心肌組織間的瘀血現(xiàn)象，進(jìn)一步造成心肌組織病理形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)心肌組織中β3整合素缺失會(huì)增加毛細(xì)血管通透性和組織液的滲漏，導(dǎo)致心肌組織的損傷[11]。

本文表明膿毒癥大鼠心肌組織中β3整合素表達(dá)顯著性下降，但其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015_3_10）