郭云貴，程曉敏，王澤瓊，于 婭，韓曉紅（武漢生物工程學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415）

4種植物激素對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

郭云貴，程曉敏，王澤瓊，于 婭，韓曉紅
（武漢生物工程學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415）

以紫蘇葉為外植體，采用單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究了植物激素對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)和黃酮積累的影響。結(jié)果表明：4種激素對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響依次為2，4-D＞6-BA＞NAA＞KT；對(duì)愈傷組織積累黃酮的影響依次為2.4-D＞6-BA＞KT＞NAA；紫蘇葉愈傷組織培養(yǎng)的最佳激素組合為6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+ KT 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L；經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)獲得的黃酮含量最高達(dá)到3.925%，遠(yuǎn)高于自然界紫蘇葉黃酮含量。上述試驗(yàn)結(jié)果說明利用組培技術(shù)獲得紫蘇黃酮有可行性。

紫蘇葉；植物激素；黃酮；愈傷組織；正交試驗(yàn)

0 引言

紫蘇（Perilla frutescens L Brit）是國家衛(wèi)生部首批頒布的藥食兼用的中藥植物之一［1］。紫蘇葉含多種營養(yǎng)成分以及迷迭香酸、多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)［2］，其中黃酮類化合物由于具有防癌抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病等療效［3］，近年來從自然界紫蘇葉中提取黃酮的研究時(shí)有報(bào)道［4-7］。但利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分已成為開發(fā)藥用植物資源的重要途徑，其中激素是組織培養(yǎng)過程中影響藥用成分含量的重要因素［8-9］?，F(xiàn)今藥用植物紫蘇葉通過組培技術(shù)誘導(dǎo)愈傷組織并生產(chǎn)迷迭香酸的研究較多。劉艷等［10］對(duì)紫蘇愈傷組織及其繼代培養(yǎng)的激素條件進(jìn)行了優(yōu)化；呂曉玲等［11］探討了激素對(duì)紫蘇葉愈傷組織積累迷迭香的影響；李會(huì)珍等［12］利用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)迷迭香；李榮貴等［13］對(duì)紫蘇愈傷組織迷迭香進(jìn)行了純化。但目前國內(nèi)利用植物組培技術(shù)生產(chǎn)紫蘇黃酮的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以紫蘇葉為外植體，利用單因素及正交試驗(yàn)探討了4種激素單獨(dú)使用和組合使用對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)和黃酮積累的影響，為后期篩選高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系大規(guī)模生產(chǎn)黃酮提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)

1.1.1 外植體消毒及接種培養(yǎng) 取紫蘇嫩葉流水洗凈后入超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2消毒6～8 min，無菌水沖洗3～4次，然后切取嫩葉中脈附近1 cm2左右的葉塊，以葉片背面平鋪于培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)物放于（25±2）℃、光照時(shí)間12 h/d的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基設(shè)計(jì) 單因素培養(yǎng)基設(shè)計(jì):以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH=5.8±0.2），每種培養(yǎng)基分別添加不同濃度的6-BA、2，4-D、KT和NAA。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（3）4正交試驗(yàn)，各因素水平如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素和水平Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算 紫蘇葉培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)有效接種數(shù)、愈傷組織形成數(shù)（以愈傷組織超過葉面積1/2為基準(zhǔn)），并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率；培養(yǎng)40 d后稱量愈傷組織重量，求取平均值。

有效接種數(shù)指接種培養(yǎng)25 d后未被污染的接種材料數(shù)；

誘導(dǎo)率/%=形成愈傷組織的有效接種數(shù)/有效接種數(shù)×100%；

愈傷組織平均重量=各處理組愈傷組織總重量/形成愈傷組織的有效接種數(shù)。

1.2 黃酮提取與含量測(cè)定

1.2.1 愈傷組織黃酮提取 將紫蘇葉和各處理組愈傷組織收集并于60℃烘干，磨成粉末后過100目篩，準(zhǔn)確稱取0.4 g入錐形瓶，加入16 mL 75%乙醇，超聲波處理40 min后，75℃水浴1 h，然后放入冷凝回流裝置中提取75 min，過濾，收集濾液并用30%乙醇定容至10 mL備用。

1.2.2 黃酮含量測(cè)定 以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法［9］測(cè)定黃酮總含量:準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用30%乙醇溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，定容得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確吸取1、2、3、4、5和6 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL刻度管中，加30%乙醇至6 mL，然后移取0.75 mL 5%NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min加入0.75 mL 10%Al（N03）3溶液，再搖勻后靜置6 min，加人5 mL 1 mol/L NaOH溶液，并用30%乙醇溶液定容，搖勻后靜置15 min，以30%乙醇為空白對(duì)照，于波長510 nm處測(cè)定吸光度 A。以質(zhì)量濃度（C）為縱坐標(biāo)，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線: y=0.073 3x-0.001，R2=0.992 2。精密移取1 mL各處理組愈傷組織提取物于25 mL刻度管中，根據(jù)上述條件加入顯色劑，用30%乙醇溶液定容至刻度，測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮含量。

黃酮含量計(jì)算公式:

式中，V0為所得待測(cè)液定容體積，mL；V1為測(cè)量移取的待測(cè)液體積，mL；V2為移取液定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為原材料質(zhì)量，g；C為被測(cè)提取液濃度，mg/mL。其中自然界紫蘇葉黃酮含量為1.930%，以此作為愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮含量的對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

紫蘇葉培養(yǎng)12 d后邊緣開始愈傷化，25 d后愈傷化明顯，且愈傷組織緊密，觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。由表2可知，試驗(yàn)組中紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度起伏變化而有明顯差異，其中6-BA 2.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到54.5%，其愈傷組織平均重量也達(dá)到最高，為0.287 g；而6-BA 3.0 mg/L時(shí)黃酮含量最高，達(dá)到2.343%。綜合愈傷組織誘導(dǎo)率、平均重量及黃酮含量，6-BA 2.0 mg/L時(shí)整體效果最好。

表2 6-BA對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響Tab.2 Effect of 6-BA on callus inducing and flavonoid formation in Perilla Frutescens Leaves

2.2 2，4-D對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2，4-D后，紫蘇葉培養(yǎng)10 d后邊緣開始愈傷化，25 d后部分愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可知，隨著2，4-D濃度升高，愈傷組織誘導(dǎo)率、平均重量和黃酮含量卻表現(xiàn)下降趨勢(shì)，且后期愈傷組織褐化嚴(yán)重。綜合3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)來看，2，4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)適宜紫蘇葉愈傷組織生長和黃酮積累。

表3 2，4-D對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響Tab.3 Effect of 2，4-D on callus inducing and flavonoid formation in Perilla Frutescens leaves

2.3 KT對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

紫蘇葉在含有KT的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后愈傷組織較緊密，多為米黃色，生長狀態(tài)沒有其他組好。觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表4。由表4可知，愈傷組織的誘導(dǎo)率和黃酮含量隨KT濃度的增加呈拋物線狀，而愈傷組織平均重量呈下降趨勢(shì)；綜合誘導(dǎo)率、愈傷組織平均重量和黃酮含量，KT濃度為0.6 mg/L時(shí)適宜紫蘇葉愈傷組織生長和黃酮積累。

表4 KT對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響Tab.4 Effect of KT on callus inducing and flavonoid formation in Perilla Frutescens leaves

2.4 NAA對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不濃度的NAA后紫蘇葉片培養(yǎng)15 d后邊緣開始愈傷化，愈傷組織相對(duì)其他組而言較緊實(shí)，觀察并且統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表5。由表5可知，NAA對(duì)紫蘇葉片愈傷誘導(dǎo)作用相對(duì)較小，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異不明顯，但仍可看出，誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；愈傷組織平均重量和黃酮含量隨NAA濃度的變化呈拋物線狀，最高組均出現(xiàn)在NAA 0.8 mg/L培養(yǎng)基中。綜合所有因素，NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)最適宜。

表5 NAA對(duì)紫蘇葉愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響Tab.5 Effect of NAA on callus inducing and flavonoid formation in Perilla Frutescens leaves

2.5 激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累的影響

將4種激素進(jìn)行正交組合后加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.6 Results and analysis of orthogonal experiment

由表6知，4種激素對(duì)紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)的影響作用依次為2，4-D＞6-BA＞KT＞NAA，最佳激素組合為A2B1C3D2，4種激素對(duì)紫蘇愈傷組織平均重量和黃酮含量的影響作用均為2，4-D＞6-BA＞NAA＞KT，愈傷組織重量最優(yōu)激素組合為A2B1C2D1，而黃酮含量的最優(yōu)激素組合為A2B1C1D1；可看出3者最優(yōu)激素組合中均有A2B1，而C和D因素在3者中都不統(tǒng)一，考慮單因素試驗(yàn)中KT濃度為0.6 mg/L和NAA濃度為0. 8 mg/L適宜，建議紫蘇葉愈傷組織培養(yǎng)積累黃酮的最優(yōu)激素組合為A2B1C3D2，即6-BA 2.0 mg/L+2.4-D 0.5 mg/L+KT 0.6 mg/L+NAA 0.8mg/L。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)。誘導(dǎo)愈傷組織最常用的生長素是NAA和2，4-D，經(jīng)常使用的細(xì)胞分裂素有6-BA和KT等。4種激素影響愈傷組織的誘導(dǎo)作用大小分別為2，4-D＞6-BA＞KT＞NAA，這與伊慶良等［14］提出的品種遺傳特性和2，4-D濃度是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素相符合。通過正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)激素組合為6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L其愈傷組織誘導(dǎo)率和平均重量均為單因素試驗(yàn)結(jié)果的兩倍，表明單一激素作用效果不如，激素之間協(xié)同作用。但激素的種類和濃度的最優(yōu)組合研究是一個(gè)龐大的系統(tǒng)，且基本培養(yǎng)基、外植體、溫度、濕度及光照條件等均有影響。

通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的愈傷組織生長速度快、質(zhì)地疏松、呈顆粒狀、易于分散，為后續(xù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)紫蘇黃酮提供了良好的培養(yǎng)體系。自然紫蘇葉黃酮含量為1.930%，但通過本試驗(yàn)可以看出無論是各激素單獨(dú)使用還是通過正交試驗(yàn)進(jìn)行激素組合所獲得的最優(yōu)處理組的黃酮含量均較自然界紫蘇葉黃酮含量高，其黃酮含量最高達(dá)到3.925%。表明利用植物組培技術(shù)從紫蘇葉中獲得黃酮這種藥用成分是一種可行的途徑。

（References）

［1］ 劉海英，仇農(nóng)學(xué)，姚瑞祺，等.我國86種藥食兩用植物的抗氧化活性及其與總酚酸的相關(guān)性分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，37（2）:173-179.

［2］ 張洪，黃建韶，趙東海.紫蘇營養(yǎng)成分的研究［J］.食品與機(jī)械，2006，22（2）:41-43.

［3］ 延璽，劉會(huì)青，鄒永青，等.黃酮類化合物的生理活性及合成研究進(jìn)展［J］.有機(jī)化學(xué)，2008，28（9）:1534-1544.

［4］ 郭曉青，陳曉靚，楊春梅，等.紫蘇葉提取物活性成分測(cè)定分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（36）:14039-14040.

［5］ 劉毅君，曾廣燁，李愛貞.超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，19（1）:21-24.

［6］ 劉寧，仇農(nóng)學(xué)，田玉霞.超聲輔助提取紫蘇葉黃酮及其清除自由基作用研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23（1）:158.

［7］ 李燕，曾慶華，陳利梅.正交試驗(yàn)法優(yōu)選紫蘇葉中總黃酮提取工藝［J］.食品工程，2011，38（2）:148-150.

［8］ 胡燕梅，唐興國，宋鵬飛，等.銀杏葉愈傷組織培養(yǎng)及黃酮積累的正交試驗(yàn)優(yōu)化［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26（9）: 59-62.

［9］ 孫軍，胡正海.紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)及紫杉醇的產(chǎn)生［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，30（1）:55-59.

［10］劉艷，李會(huì)珍，張志軍.紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（10）:146-151.

［11］呂曉玲，孫晶磊，王芳，等.外源激素對(duì)紫蘇愈傷誘導(dǎo)及迷迭香酸積累的影響［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（6）: 575-580.

［12］李會(huì)珍，張志軍，喬紹俊.紫蘇細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)迷迭香酸條件研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（9）:149-153.

［13］李榮貴，騰大為，杜桂彩，等.紫蘇愈傷組織迷迭香酸的純化及抗菌活性研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27（5）:324-327.

［14］伊慶良，劉世強(qiáng).水稻懸浮細(xì)胞系及其單細(xì)胞培養(yǎng)的研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，25（4）:366-372.

（責(zé)任編輯:胡燕梅）

Effect of Four Plant Hormone on Callus Induction and Flavonoid Formation in Perilla Frutescens Leaves

GUO Yungui，CHENG Xiaomin，WANG Zeqiong，YU Ya，HAN Xiaohong
（Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，Hubei，China）

In this study，with the leaves of Perilla frutescens were used as explant，effect of different concentrations of the hormone on inducing callus and formating flavonoid in Perilla frustescens leaves were studied by single factor and orthogonal test.It was found that the effect order of four kind of hormones to callus induction was 2，4-D＞6-BA＞NAA＞KT and the order to flavonoid formation of callus was 2，4-D＞6-BA＞KT＞NAA，the optimum medium for callus induction was 6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L by orthogonal design，under the optimum conditions，the highest indution rate was 83.3%after 25 days.Furthemore，the flavonoid formation of callus achieved at 3.925%，it is much higher than the natural Perilla frustescens leaves，the experimental results indicate the feasibility of flavonoid formation with tissue engineering.

Perilla frutescens；plant hormone；flavonoids；callus；orthogonal test

Q813.12

A

1673-0143（2015）05-0460-05

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.016

2015-04-20

武漢市市屬高校產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目（CXY201434）

郭云貴（1977—），女，副教授，碩士，研究方向：動(dòng)植物細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)。