張?chǎng)斡?劉皈陽(yáng) 劉浩 馬濤

肺癌是當(dāng)今發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌的80%左右。大部分肺癌患者被確診時(shí)已經(jīng)屬于晚期，導(dǎo)致患者的5年生存率往往低于10%[1]。以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）為靶點(diǎn)的分子靶向治療成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。吉非替尼、厄洛替尼以及國(guó)產(chǎn)的?？颂婺岬仁蔷哂锌诜钚钥赡娴男》肿永野彼峒っ敢种苿╰yrosine kinase inhibitors,TKIs），被廣泛應(yīng)用于晚期進(jìn)展的NSCLC，此類藥物在胞內(nèi)和ATP競(jìng)爭(zhēng)酪氨酸激酶殘基的結(jié)合位點(diǎn)，阻止酪氨酸激酶殘基自身磷酸化而抑制下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[2]。然而臨床觀察[3]中發(fā)現(xiàn)，雖然TKIs在攜帶優(yōu)勢(shì)突變的患者中顯示出較好的反應(yīng)率，但獲得性耐藥卻不可避免的尾隨而至，一般出現(xiàn)在最初治療1年內(nèi)。在所有的獲得性耐藥的可能機(jī)制中，EGFR 20外顯子T790M[4]突變約占50%，是最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制。從發(fā)現(xiàn)耐藥的那一刻起，逆轉(zhuǎn)耐藥的研究也一直沒(méi)有停止過(guò)。根據(jù)TKIs治療失敗的分子機(jī)制研究主要有靶向T790M耐藥突變開(kāi)發(fā)的第三代不可逆的TKIs等；各項(xiàng)研究顯示在腫瘤無(wú)進(jìn)展生存期、毒副反應(yīng)以及疾病緩解率等方面都有優(yōu)勢(shì)。但真正走向臨床服務(wù)于患者還需要一個(gè)過(guò)程。這段時(shí)間中，面對(duì)越來(lái)越多TKIs治療失敗后仍需治療或仍有強(qiáng)烈治療意愿的患者，需要在已有的治療藥物基礎(chǔ)上探索新的治療模式，既往相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)合理的化療聯(lián)合靶向治療模式在NSCLCEGFR突變野生型和敏感型細(xì)胞株中均顯示有協(xié)同作用[5-7]。已有臨床醫(yī)生根據(jù)TKIs治療階段以及治療過(guò)程中患者對(duì)TKIs的反應(yīng)，借助臨床現(xiàn)有的藥物和治療手段，不斷地嘗試逆轉(zhuǎn)耐藥，主要嘗試有鉑類聯(lián)合紫杉類化療、化療聯(lián)合靶向、化療后序貫原靶向藥物，以及更換另外一種TKI等模式。雖然大都為小規(guī)模嘗試治療的總結(jié)，證據(jù)級(jí)別不高，但經(jīng)驗(yàn)可貴，值得借鑒[8,9]。

基于上述信息，我們發(fā)現(xiàn)占獲得性耐藥比例最高的T790M突變?nèi)巳褐?，有關(guān)中藥及其相關(guān)制劑與靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究較少，因此對(duì)于具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的中藥及其制劑，值得我們?cè)诖朔较蜻M(jìn)行嘗試性探索[10]。

雷公藤甲素又名雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取分離出來(lái)的活性最高的含有3個(gè)環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤的主要活性成分之一。其相關(guān)效價(jià)比雷公藤總苷高100倍-200倍。經(jīng)藥理和臨床試驗(yàn)表明其具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗生育等多種生物活性，體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，臨床上得以廣泛應(yīng)用，主要用于治療自身免疫性疾病和器官移植的排斥反應(yīng)[11]。從20世紀(jì)70年代揭開(kāi)其具有抗腫瘤作用后，近年來(lái)其抗腫瘤作用逐漸為大家所認(rèn)識(shí)并引起廣泛重視。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雷公藤甲素及其衍生物雷公藤氯內(nèi)酯醇對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，可能的機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬有關(guān)[12]，但在EGFR-TKIs耐藥的H1975（EGFR exon 20 T790M-exon 21 L858R）細(xì)胞株上未見(jiàn)到相關(guān)研究[13]。

本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索雷公藤甲素和吉非替尼在攜帶T790M突變的NSCLC獲得性耐藥細(xì)胞株H1975上合理的給藥模式，并探討產(chǎn)生不同結(jié)果的機(jī)制。一方面進(jìn)一步完善此方向研究；另一方面為T(mén)790M獲得性耐藥的后續(xù)治療提供一些值得借鑒的基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞H1975購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所，MTT、DMSO、吉非替尼、雷公藤甲素均購(gòu)自Sigma公司。吉非替尼與雷公藤甲素均溶于DMSO中，分別以40 mmol/L與100 μmol/L過(guò)濾分裝后于-20 ℃保存，凋亡細(xì)胞染色試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司，Annexinv-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，DNA含量（細(xì)胞周期）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D Systems。流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為Biocell2010公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青霉素與鏈霉素（終濃度為100 U/mL）的RPMI-1640（Gibco公司）培養(yǎng)液，常規(guī)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行消化傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)H1975生長(zhǎng)作用的影響 通常認(rèn)為在MTT檢測(cè)中空白對(duì)照組在波長(zhǎng)570 nm的吸光度為0.8-1.2時(shí)，不同抑制組與空白組間區(qū)分效果較好，由上述方法確定H1975的鋪板數(shù)為5,000個(gè)/孔。

1.2.2.1 單藥MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前一天晚上取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)后完全培養(yǎng)基稀釋到上述相應(yīng)濃度后，取100 μL到96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，加入200 μL完全培養(yǎng)基配置好的含不同藥物不同濃度的藥液，每個(gè)濃度至少6個(gè)復(fù)孔，設(shè)置空白組和對(duì)照組?？瞻捉M只加培養(yǎng)液，對(duì)照組不加藥物。培養(yǎng)72 h后每孔加用PBS配成的5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h-6 h后小心吸棄上清，每孔加150 μL DMSO，置水平搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度[14,15]。分別計(jì)算各加藥組的抑制率。所有細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，求得平均抑制率，細(xì)胞存活率=（A用藥組/A對(duì)照組）×100%，細(xì)胞抑制率=（1-A用藥組/A對(duì)照組）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.2.2 不同時(shí)序給藥方案的增殖抑制實(shí)驗(yàn) 時(shí)序方案分組如下：①雷公藤甲素作用24 h，PBS洗滌1遍，吉非替尼繼續(xù)序貫48 h（TG）；②雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1遍，不含藥液的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h（T+G）；③吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1遍，雷公藤甲素繼續(xù)序貫24 h（GT）。不同時(shí)序方案下的兩藥給藥濃度根據(jù)上述單藥MTT的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）值的比率進(jìn)行確定，兩藥在每種方案下的給藥配比劑量分別為各自單藥IC50的0倍、0.25倍、0.5倍、1倍、2倍、4倍。MTT方法同上述單藥實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)3次以上。

1.2.3 兩藥時(shí)序使用效應(yīng)的評(píng)估

1.2.3.1 Isobolograms等效線圖法 通過(guò)Steel和Peckham[16]的Isobolograms來(lái)評(píng)價(jià)IC80（抑制80%細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度）水平，Isobolograms法是判定聯(lián)合用藥體外發(fā)生協(xié)同、相加、拮抗作用的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法，適用于毒性機(jī)制不明以及多種抗癌因子聯(lián)合作用下的量效曲線研究。Isobolograms的概念在先前的研究中有過(guò)詳細(xì)的描述[17]。

1.2.3.2 聯(lián)合指數(shù)分析 以MTT法測(cè)得單藥不同藥物劑量的抑制率后可以得到細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線，采用CalcuSyn分析軟件計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（combination index, CI）。聯(lián)合指數(shù)的公式為CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(D)1、(D)2分別為聯(lián)合用藥時(shí)兩藥各自的濃度，Dx為聯(lián)合用藥達(dá)fa時(shí)，單藥抑制率也達(dá)到fa時(shí)所需要的藥物濃度，Dx=Dm[fa/(1-fa)]1/m，fa表示一定濃度的兩藥聯(lián)合用藥達(dá)到的抑制率。通過(guò)軟件輸入單藥的劑量及抑制率可得到Dm值和m值，再經(jīng)上述聯(lián)合指數(shù)計(jì)算公式就可得到某種聯(lián)合用藥方案的效應(yīng)，CI＜1表示此方案具有協(xié)同效應(yīng)[18]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀Annexin V/7-AAD雙染色法檢測(cè)不同給藥方案下H1975細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)前一天晚上取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)后完全培養(yǎng)基稀釋到1×106個(gè)/mL，取500 μL至25 cm培養(yǎng)瓶中，加完全培養(yǎng)基至5 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，加入5 mL完全培養(yǎng)基配置好的含不同藥物濃度的藥液。到達(dá)作用時(shí)間后，不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)收集5×105個(gè)-1×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μL-1,000 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個(gè)/mL。從以上細(xì)胞懸液中吸取100 L轉(zhuǎn)移到5 mL流式上樣管中，分別加入5 μL 7-AAD和PE-Annexin V染液，室溫避光反應(yīng)至少15 min，最后向每支流式管中加入300 μL-400 μL Binding Buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=578 nm，每次實(shí)驗(yàn)均需在正常細(xì)胞組中設(shè)立3組對(duì)照：①不加染料組；②7-AAD單染組；③PE-Annexin V單染組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對(duì)照（無(wú)藥物作用）72 h組（N）；②雷公藤甲素單獨(dú)作用72 h組（T）；③吉非替尼單獨(dú)作用72 h組（G）；④雷公藤甲素作用24 h，PBS洗滌1次后序貫吉非替尼48 h組（TG）；⑤雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼48 h，PBS洗滌1次后序貫不含藥液的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h組（T+G）；⑥吉非替尼作用48 h，PBS洗滌1次后序貫雷公藤甲素24 h組（GT）。每種方案下的給藥劑量分別為MTT單藥實(shí)驗(yàn)中的IC50。

1.2.5 Hoechst 33258 DNA染色檢測(cè)凋亡 實(shí)驗(yàn)分組同上，收集各組細(xì)胞到1.5 mL EP管中，4%多聚甲醛重懸細(xì)胞沉淀固定，1,000 rpm低速離心，吸棄固定液，PBS洗滌1次，將少量細(xì)胞懸液滴到載玻片上，涂布，風(fēng)干；使用配制好的Hoechst 33342工作液，重懸細(xì)胞，室溫孵育10 min以上；吸棄染色液，PBS洗滌1次，封片。每組細(xì)胞至少涂片5張，每張細(xì)胞涂片在Olympus熒光顯微鏡200倍視野下觀察8個(gè)不同視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同給藥方案下H1975細(xì)胞周期分布 實(shí)驗(yàn)分組和給藥劑量同凋亡實(shí)驗(yàn)，到達(dá)作用時(shí)間后，胰蛋白酶-EDTA消化液消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞1次，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，70%冰乙醇固定，4 ℃保存，染色前PBS洗去固定液，加100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，再避光加入400 μL PI染液混勻，4 ℃避光30 min，上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.7 Caspase活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組和給藥劑量同凋亡實(shí)驗(yàn)，收集2×106個(gè)-6×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，加50 μL-150 μL冰冷的Lysis Buffer（25 μL/1×106細(xì)胞），冰上孵育10 min，離心10,000g、3 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，取少量上清（5 μL），Braford法測(cè)定其中的蛋白濃度；吸取50 μL含100 g-200 g蛋白裂解上清；如體積不足50 μL用Lysis Buffer補(bǔ)足至總體積50 μL，加入50 μL的2×Reaction Buffer（注意：使用前每50 μL 2×Reaction Buffer加入0.5 μL DTT，Reaction Buffer要一一對(duì)應(yīng)）；根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤? μL Caspase-3（DEVD-AFC）、Caspase-8（IETD-AFC）或者Caspase-9（LEHD-AFC），并于37 ℃避光孵育2 h。酶標(biāo)儀λ=405 nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase的活化程度。同時(shí)設(shè)置空白組（50 μL Lysis Buffer+50 μL 2×Reaction Buffer+5 μL底物）以及不含底物的陰性組（50 μL含蛋白Lysis Buffer+50 μL 2×Reaction Buffer）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異分析采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單藥MTT對(duì)H1975生長(zhǎng)的影響 雷公藤甲素和吉非替尼作用72 h對(duì)H1975細(xì)胞抑制作用的IC50值分別為（26.9±3.8）nmol/L、（9.9±0.9）μmol/L，并且呈濃度依賴性抑制H1975的生長(zhǎng)（圖1）。

2.2 不同時(shí)序給藥方案對(duì)H1975增殖抑制作用 根據(jù)吉非替尼和雷公藤甲素單藥的MTT結(jié)果，近似取IC50的整數(shù)值，吉非替尼為10 μmol/L，雷公藤甲素為25 nmol/L。按照上述設(shè)計(jì)的3種時(shí)序給藥方案和藥物配比劑量進(jìn)行MTT試驗(yàn)，得到的結(jié)果見(jiàn)圖2。其中A、B、C分別代表雷公藤甲素序貫吉非替尼組、雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼組以及吉非替尼序貫雷公藤甲素組?？v坐標(biāo)顯示的是H1975的存活率，橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)的是雷公藤甲素和吉非替尼的濃度配比。依據(jù)3種給藥模型中兩藥單藥量效曲線可進(jìn)一步繪制IC80下不同方案等效線圖，從而評(píng)價(jià)模型之間的優(yōu)劣。同時(shí)可以進(jìn)行3種模型聯(lián)合用藥指數(shù)CI的分析。

2.3 不同時(shí)序模型給藥方案效果的評(píng)價(jià)

2.3.1 等效線圖法 依據(jù)3種給藥模型中吉非替尼和雷公藤甲素單藥量效曲線繪制IC80下3種方案的等效線圖模型（圖3）。同時(shí)進(jìn)行3種模型聯(lián)合用藥指數(shù)CI的分析（表1）。圖4中A、B、C分別代表雷公藤甲素24 h序貫吉非替尼組48 h、雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼組48 h以及吉非替尼48 h序貫雷公藤甲素24 h組的等效線圖，各圖中橫縱坐標(biāo)數(shù)值1分別代表每種模型下吉非替尼或雷公藤甲素單藥作用后的IC80值。A圖中固定吉非替尼劑量后，變換雷公藤甲素的劑量得到的5個(gè)IC80等效點(diǎn)中3個(gè)點(diǎn)落在IC80等效口袋區(qū)域的左側(cè)，2個(gè)點(diǎn)處于等效區(qū)域的左側(cè)邊緣位置，說(shuō)明雷公藤甲素序貫吉非替尼組主要表示為協(xié)同作用或接近強(qiáng)相加作用。B圖中5個(gè)IC80等效點(diǎn)皆處于IC80等效口袋區(qū)域內(nèi)，且大都處于區(qū)域靠右側(cè)位置，說(shuō)明雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼主要表示為相加作用。C圖中5個(gè)IC80等效點(diǎn)皆處于IC80等效區(qū)域右側(cè)且遠(yuǎn)離等效區(qū)域，說(shuō)明吉非替尼序貫雷公藤甲素主要為弱相加或拮抗作用。

2.3.2 中位線效應(yīng)法 對(duì)3種給藥模型得到的原始數(shù)據(jù)按照聯(lián)合用藥指數(shù)法進(jìn)行分析采用CalcuSyn軟件計(jì)算聯(lián)合用藥的CI值，具體結(jié)果見(jiàn)表1-表3。從CI的概念來(lái)講，CI＞1說(shuō)明藥物間為拮抗作用，CI=1說(shuō)明藥物間為相加作用，CI＜1說(shuō)明藥物間為協(xié)同作用。CI值越小，協(xié)同的效應(yīng)越強(qiáng)烈。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，通常認(rèn)為CI＜0.3表示強(qiáng)烈協(xié)同效應(yīng)，0.3＜CI＜0.7為中度協(xié)同效應(yīng)，0.7 CI＜1.0為較弱的協(xié)同效應(yīng)。表1結(jié)果顯示大部分值小于1，在吉非替尼低劑量的組別中個(gè)別值接近1或略高于1，說(shuō)明雷公藤甲素序貫吉非替尼組主要表現(xiàn)為強(qiáng)協(xié)同或中度協(xié)同作用。表2結(jié)果顯示大部分結(jié)果在1附近，在吉非替尼低劑量組別高于1的現(xiàn)象，說(shuō)明雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼主要表現(xiàn)為相加作用。表3結(jié)果顯示大部分值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)1，表示吉非替尼序貫雷公藤甲素主要表現(xiàn)為拮抗作用。

2.4 Annexin V/7-AAD雙染色法檢測(cè)吉非替尼和雷公藤甲素誘導(dǎo)H1975細(xì)胞的凋亡 采用流式細(xì)胞儀分析方法進(jìn)一步確定雷公藤甲素序貫吉非替尼是否導(dǎo)致最高的凋亡率。共設(shè)計(jì)6種給藥方案，其中包括空白對(duì)照組以及雷公藤甲素和吉非替尼單藥組（圖4A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，10 μmol吉非替尼單藥（10.71±0.51）以及吉非替尼序貫雷公藤甲素（6.41±0.64）方案均未引起H1975出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，吉非替尼聯(lián)合雷公藤甲素同吉非替尼單藥以及雷公藤甲素序貫吉非替尼與空白組比較皆誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯凋亡（P＜0.05），而且雷公藤甲素單藥（19.63±1.31）與雷公藤甲素序貫吉非替尼（23.41±0.74）方案較雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼方案（16.15±1.21）在誘導(dǎo)凋亡結(jié)果上也具有明顯差異（P＜0.05）。但雷公藤甲素單藥和雷公藤甲素序貫吉非替尼兩種方案間未能得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，數(shù)值上雷公藤甲素序貫吉非替尼組略顯優(yōu)勢(shì)（圖4B）。

圖1 不同濃度的雷公藤甲素（左）與吉非替尼（右）作用72 h對(duì)H1975細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（n=3）Fig1 Effects of triptolide (left) and gefitinib (right) on the proliferation of H1975 cells for 72 h (n=3)

圖2 吉非替尼和雷公藤甲素在H1975細(xì)胞株中的時(shí)序依賴關(guān)系（n=3）。A：雷公藤甲素24 h后吉非替尼48 h；B：雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼48 h序貫24 h不含藥完全培養(yǎng)基；C：吉非替尼48 h序貫雷公藤甲素24 h。Fig2 Schedule dependence of the interaction between Gefitinib and Triptolide in H1975 (n=3). A: Pretreated with triptolide 24 h, followed by gefitinib for 48 h; B: Treated concomitantly with gefitinib and triptolide for 48 h and incubated in drug-free medium for 24 h; C: Pretreated with gefitinib 48 h, followed by triptolide for 24 h. TG:Triptolide followed by Gefitinib; T+G: Triptolide plus Gefitinib; GT: Gefitinib followed by Triptolide.

圖3 雷公藤甲素與吉非替尼時(shí)序作用下的等效線圖（n=3）。A：雷公藤甲素24 h后吉非替尼48 h；B：雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼48 h序貫24 h不含藥完全培養(yǎng)基；C：吉非替尼48 h序貫雷公藤甲素24 h。數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)平均值。Fig3 Isobologram of triptolide in combination with gefitinib (n=3). A: Pre-treated with triptolide 24 h, followed by gefitinib for 48 h; B: Treated concomitantly with gefitinib and triptolide for 48 h and incubated in drug-free medium for 24 h; C: Pretreated with gefitinib 48 h, followed by triptolide for 24 h.

表1 雷公藤甲素序貫吉非替尼組的聯(lián)合用藥指數(shù)結(jié)果Tab1 The result of CI to pretreated with triptolide followed by gefitinib

2.5 藥物處理后Hoechest 33258染色結(jié)果 藥物誘導(dǎo)凋亡的H1975細(xì)胞，Hoechest 33258染色后顯示藍(lán)染的凋亡小體和細(xì)胞核。與完整、圓形、大型的細(xì)胞核相比，單個(gè)凋亡小體呈細(xì)小不規(guī)則顆粒狀，同一細(xì)胞內(nèi)（紅色箭頭指示處）可出現(xiàn)大小不等的多個(gè)凋亡小體（圖5）。

2.6 不同給藥方式對(duì)細(xì)胞周期的影響 給藥劑量和實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，不同作用方式下的結(jié)果都以正常為基準(zhǔn)進(jìn)行比較，流式圖結(jié)果見(jiàn)圖6，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，吉非替尼單藥主要將細(xì)胞抑制在G0/G1期（59.82±3.41）（P＜0.05），而單藥雷公藤甲素作用后，G2/M期的細(xì)胞明顯增多（45.68±1.51）（P＜0.05），同樣在吉非替尼序貫雷公藤甲素方案中G0/G1期細(xì)胞高達(dá)（61.51±3.92）（P＜0.05），而雷公藤甲素序貫吉非替尼組G0/G1期細(xì)胞僅占（33.73±2.81），G2/M期細(xì)胞比例則為（42.95±1.39）（P＜0.05）。由此可見(jiàn)吉非替尼單藥或吉非替尼序貫雷公藤甲素組主要誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，而雷公藤甲素單藥或雷公藤甲素序貫吉非替尼組主要誘導(dǎo)G2/M期阻滯。

圖5 不同方法處理72 h后H1975凋亡形態(tài)改變（n=3）。紅色箭頭所指為凋亡細(xì)胞Fig5 The apoptosis of H1975 in dealing with different methods after 72 h (n=3). The red arrow refers to apoptotic cells.

圖6 吉非替尼與雷公藤甲素聯(lián)合作用于H1975細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞周期分布（n=3）。與正常培養(yǎng)組對(duì)比其他組的周期分布。#：與GT/G組比較，P＜0.05。*：與T/TG組比較，P＜0.05。Fig6 Cell cycle distribution of H1975 cells exposed to gefitinib and triptolide in different sequences (n=3). Relative cell cycle distribution levels to control. #: Compared with GT/G group, P＜0.05; *: Compared with T/TG group, P＜0.05.

圖7 吉非替尼與雷公藤甲素聯(lián)合下Caspase的活化情況（n=3）。*：與T/TG組比較，P＜0.05。#：與T/TG組比較，P＜0.05。Fig7 The activities of caspases to gefitinib and triptolide in different sequences (n=3). *: Compared with T/TG group, P＜0.05; #: Compared with T/TG group, P＜0.05.

表2 雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼的聯(lián)合用藥指數(shù)結(jié)果Tab2 The result of CI to treated gefitinib combination with triptolide

表3 吉非替尼序貫雷公藤甲素的聯(lián)合用藥指數(shù)結(jié)果Tab3 The result of CI to pretreated with gefitinb followed by triptolide

2.7 不同給藥方式下Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性情況 由方法中可知Caspase的活化程度可以通過(guò)計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他組相比，雷公藤甲素單藥組同雷公藤甲素序貫吉非替尼組Caspase-3的活性分別為（2.23±0.36）和（2.51±0.21）（P＜0.05），Caspase-9的活性分別為（2.61±0.31）和（2.11±0.23）（P＜0.05），而所有組Caspase-8的活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7）。

3 討論

EGFR的異常表達(dá)和活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，使EGFR成為腫瘤治療的理想靶位，第一代TKIs通過(guò)抑制EGFR及其下游信號(hào)磷脂酰肌醇三羥基激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase and protein kinase B, PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（mitogen-activated protein kinases/extracellular signalreglated kinases, MAPK/Erk1/2）傳導(dǎo)，從而然抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)凋亡，大大提高了晚期EGFR突變患者的無(wú)疾病生存時(shí)間和緩解率，但大部分患者或早或晚都將出現(xiàn)耐藥。其中20外顯子790位T突變?yōu)镸（蛋白水平表現(xiàn)為蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔┦悄[瘤對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥的重要原因，約占50%。H1975細(xì)胞為攜帶21外顯子敏感性突變的雙突變耐藥細(xì)胞株，雙突變?cè)斐傻腁TP親和力的恢復(fù)使得加大的治療窗重新關(guān)閉，表現(xiàn)為對(duì)TKIs的獲得性耐藥。我們經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出了得到吉非替尼和雷公藤甲素單藥作用72 h對(duì)H1975細(xì)胞抑制作用的IC50值分別為（9.93±0.91）mol/L和（26.91±3.82）nmol/L，在以往報(bào)道[19]的范圍之內(nèi)。TKIs耐藥后的臨床治療一直處于探索階段，比如在耐藥后進(jìn)行鉑類聯(lián)合紫杉類化療、化療聯(lián)合靶向治療、化療后序貫原靶向治療以及更換另外一種TKIs藥物的嘗試均有報(bào)道[20]。但從以上相關(guān)報(bào)道我們發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)T790M導(dǎo)致的耐藥的探索過(guò)程中有關(guān)中藥及其相關(guān)制劑與靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究較少，而雷公藤甲素近些年來(lái)被廣泛報(bào)道應(yīng)用于不同種類的癌癥治療中，同樣在NSCLC方面，無(wú)論在體外和體內(nèi)，可以明顯抑制相應(yīng)腫瘤細(xì)胞和移植瘤。因此探究雷公藤甲素和TKIs合理治療模式對(duì)于探索T790M導(dǎo)致的獲得性耐藥有一定的參考價(jià)值。

聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中的“協(xié)同”是指“1+1＞2”的效果，針對(duì)攜帶T790M突變的H1975細(xì)胞株，我們?cè)O(shè)計(jì)了3種序貫方案來(lái)考察哪種方案的療效最佳。常用于評(píng)估兩藥聯(lián)合效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有Isobolograms模型、Bliss additivism模型及CI方法。Isobolograms模型和CI方法均是基于IC50進(jìn)行計(jì)算的[21]。本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)達(dá)到了使用Isobolograms模型和CI方法的條件。所以我們同時(shí)選擇這兩種方法來(lái)體外評(píng)價(jià)上述3種給藥方案對(duì)H1975存活的影響。

研究結(jié)果顯示，先用雷公藤甲素24 h后序貫吉非替尼48 h組中5個(gè)IC80等效點(diǎn)中4個(gè)點(diǎn)落在IC80等效口袋區(qū)域的左側(cè)，相對(duì)于雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼48 h組（5個(gè)點(diǎn)皆處于IC80等效口袋區(qū)域內(nèi)，指示為相加作用）以及吉非替尼48 h后序貫雷公藤甲素24 h組（5個(gè)IC80等效點(diǎn)皆處于IC80等效區(qū)域右側(cè)，指示為弱相加或拮抗作用）表示為協(xié)同作用或接近強(qiáng)相加作用。表1-表3中的CI值同樣也證實(shí)了Isobolograms模型的結(jié)論，即雷公藤甲素序貫吉非替尼組較其他兩種給藥方式具有協(xié)同增效作用。

目前有報(bào)道[22]稱吉非替尼低濃度僅引起細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，只有高濃度才會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，并且凋亡主要經(jīng)死亡受體途徑誘導(dǎo)。而雷公藤甲素抑制NSCLC可能的方式為干擾細(xì)胞周期，激活caspase信號(hào)通路、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或抑制NF-?B的活性有關(guān)，但未見(jiàn)有明確結(jié)論[23]。因此我們?cè)诩?xì)胞毒性數(shù)據(jù)及3種序貫給藥方式的基礎(chǔ)上，增加空白組和單藥組，對(duì)不同方案下細(xì)胞死亡方式中的凋亡途徑進(jìn)行初步研究，探討不同用藥組下細(xì)胞周期分布情況，觀察不同凋亡途徑的交叉和影響，進(jìn)一步解釋不同方案間存在的療效差異現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀分析方法檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雷公藤甲素單藥與雷公藤甲素序貫吉非替尼在誘導(dǎo)凋亡結(jié)果上較其它組具有明顯差異，數(shù)值上雷公藤甲素序貫吉非替尼組略顯優(yōu)勢(shì)。而單藥吉非替尼和吉非替尼序貫雷公藤甲素組，未誘導(dǎo)出明顯凋亡。細(xì)胞周期分布實(shí)驗(yàn)中單藥雷公藤甲素和雷公藤甲素序貫吉非替尼組，細(xì)胞主要被抑制在G2/M期，而單藥吉非替尼和吉非替尼序貫雷公藤甲素組，細(xì)胞主要被抑制在G0/G1期。Caspase活化結(jié)果顯示單藥雷公藤甲素和雷公藤甲素序貫吉非替尼組，Caspase-3、Caspase-9明顯活化，而Caspase-8與對(duì)照組相比，不僅未被誘導(dǎo)活化，而且活性均有一定程度的抑制。

研究發(fā)現(xiàn)化療與EGFR-TKIs聯(lián)合應(yīng)用于不同NSCLC細(xì)胞，只有細(xì)胞EGFR磷酸化（pEGFR）水平增加者才能從后續(xù)的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴(kuò)增無(wú)關(guān)，也就是說(shuō)先雷公藤甲素后吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平會(huì)明顯增高，明顯提高了后續(xù)吉非替尼的療效。同時(shí)吉非替尼為細(xì)胞周期非特異性藥物，使大量細(xì)胞在雷公藤甲素誘導(dǎo)的G2/M期死亡。而吉非替尼與雷公藤甲素同時(shí)應(yīng)用或吉非替尼后序貫雷公藤甲素時(shí)，吉非替尼把細(xì)胞大量抑制在G0/G1期，而低濃度的雷公藤甲素主要把細(xì)胞阻滯在S期，高濃度時(shí)主要把細(xì)胞阻滯在G2/M期，被吉非替尼大量抑制在G0/G1期的細(xì)胞導(dǎo)致雷公藤甲素的療效大打折扣，而吉非替尼導(dǎo)致的EGFR和ERK磷酸化下調(diào)作用也不能被同時(shí)或序貫應(yīng)用的雷公藤甲素逆轉(zhuǎn)，結(jié)果說(shuō)明上述兩種方案未能增強(qiáng)細(xì)胞抑制作用，可能與吉非替尼把細(xì)胞大量抑制在G0/G1期和雷公藤甲素細(xì)胞周期選擇性抑制以及逆轉(zhuǎn)EGFR和ERK磷酸化下調(diào)失敗有關(guān)。Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中、具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。他們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性地切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵，負(fù)責(zé)選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。Caspase-8、Caspase-9為起始者胱天蛋白酶，Caspase-3為效應(yīng)者胱天蛋白酶。Caspase-8主要作用于死亡受體途徑，Caspase-9則主要存在于線粒體途徑中。二者最終都通過(guò)活化下游的Caspase-3來(lái)造成細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與空白組比較，各用藥方案皆主要通過(guò)線粒體途徑中的Caspase-9前體活化從而激活Caspase-3來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且雷公藤甲素序貫吉非替尼組Caspase-3、Caspase-9的活化程度遠(yuǎn)高于吉非替尼聯(lián)合雷公藤甲素組以及吉非替尼序貫雷公藤甲素組，卻低于雷公藤甲素單藥組。然而流式結(jié)果顯示雷公藤甲素序貫吉非替尼組的凋亡率反而略高于雷公藤甲素單藥組。值得我們注意的是，所有實(shí)驗(yàn)組的Caspase-8的活性并未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這引發(fā)了我們的思考：是否存在兩藥聯(lián)合后，吉非替尼激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或NF-?B的活性，從而提高了雷公藤甲素的藥理學(xué)活性，而這些結(jié)果同凋亡之間存在什么樣的關(guān)系仍值得我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探索。

中醫(yī)藥是我國(guó)的國(guó)粹，幾千年來(lái)積累了豐富臨床應(yīng)用實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為深入研究天然藥物提取物的抗腫瘤特性提供了很好的技術(shù)和理論支持，雷公藤甲素是一種傳統(tǒng)中藥，在肺癌的治療過(guò)程中仍具有很大潛力等待挖掘。本研究在吉非替尼耐藥的H1975細(xì)胞株上發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素序貫吉非替尼與吉非替尼聯(lián)合雷公藤甲素及吉非替尼序貫雷公藤甲素相比具有協(xié)同增效作用，為臨床晚期TKIs耐藥后T790M突變的患者的治療提供了一條很好的臨床思路，尤其為體力狀態(tài)較好的患者帶來(lái)了一絲希望。但序貫方案的優(yōu)化和給藥劑量的詳細(xì)確定仍有待進(jìn)一步體內(nèi)和臨床實(shí)驗(yàn)的研究。在死亡相關(guān)的凋亡通路中，不同給藥方案主要都是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，同時(shí)雷公藤甲素序貫吉非替尼組誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象仍值得深入研究。