王 浪， 譚顯東， 胡 偉， 羊依金

（成都信息工程大學資源環(huán)境學院，四川成都610225）

三七渣是三七提取皂苷后的廢棄物，目前主要采用露天堆放、焚燒或填埋的方式進行處置，不僅造成了大量生物質資源的浪費，還會帶來二次污染。研究表明，三七渣中富含淀粉、蛋白質、氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等多種營養(yǎng)物質以及三七多糖等生物活性成分（楊智等，1994）。采用三七渣替代常規(guī)飼料原料作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基使用，可以降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)其資源化利用。三七渣經(jīng)米曲霉發(fā)酵后所得的發(fā)酵培養(yǎng)物中含有大量的淀粉酶，可以作為飼料添加劑使用。本研究采用單因素試驗和正交試驗對米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)淀粉酶的工藝條件進行了研究和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉（Aspergillus oryzae），由山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院保藏與提供。

1.1.2 三七渣 三七渣，由四川省某中成藥集團提供，經(jīng)自然風干、烘干、粉碎、過篩后，置于干燥器中備用。其組成成分的質量分數(shù)為：粗淀粉33.13%，粗蛋白質12.28%，真蛋白質9.97%，還原糖1.37%。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1000mL，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH值自然，121℃滅菌30 min，用于米曲霉的培養(yǎng)和種子液的制備。

三七渣培養(yǎng)基：過60目篩的三七渣10 g，培養(yǎng)基含水率為65%，初始pH自然，培養(yǎng)基于121℃滅菌30 min，用于米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的研究。除特殊說明外，本試驗所用培養(yǎng)基組成均為此。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將在PDA上培養(yǎng)3 d的米曲霉菌種，用滅過菌的無菌水沖洗，制備孢子懸浮液，制備的菌懸液濃度為2×107個/mL。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 除特殊說明外，米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)過程如下：在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入10%的米曲霉孢子菌懸浮液 （即在10.0 g三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1 mL菌懸浮液，即為10%的接種量，下同），將其置于PYX-280M-C霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為5 d。

1.2.3 酶液的制備 稱取1.000 g發(fā)酵培養(yǎng)物（濕物料）于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水并充分攪拌使其均勻懸浮，再將其放入40℃的恒溫水浴鍋中浸提60 min后，用8層紗布過濾上述提取液，再將濾液經(jīng)5000 r/min離心10 min后取其上清液置于4℃下保存，備用。

1.2.4 淀粉酶活的測定 淀粉酶活的測定參照芶琳和單志（2010）的方法。

酶活單位定義為：在試驗條件下，5 min內降解1 mg/mL的淀粉溶液生成1 μmol還原糖需要的酶量，定義為1個酶活單位，記為U/g濕物料。

1.2.5 單因素試驗 分別考察氮源添加量、初始含水量、培養(yǎng)時間、三七渣粒徑對產(chǎn)淀粉酶的影響。

1.2.6 正交試驗 選取培養(yǎng)時間、三七渣粒徑和含水率3個因素，進行L9（33）正交試驗。

本次研究中每個試驗結果均為3個平行試驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 硫酸銨添加量對產(chǎn)淀粉酶的影響 在三七渣基質中按照一定比例（0%～5%）添加硫酸銨，考察氮源添加量對產(chǎn)酶的影響，結果見圖1。

圖1 硫酸銨添加量對產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖1可見，不添加硫酸銨時發(fā)酵培養(yǎng)物的淀粉酶活最高，隨著硫酸銨添加量的增加，淀粉酶活反而逐漸減小，最終趨于平穩(wěn)，這說明三七渣中主要營養(yǎng)成分比較均衡，其碳氮比合適淀粉酶的生產(chǎn)。Swetha等（2007）采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵工農(nóng)業(yè)廢料產(chǎn)淀粉酶，結果發(fā)現(xiàn)，添加氮源并未促進淀粉酶的增加，與本試驗結果類似。但胡偉等（2013）卻發(fā)現(xiàn)采用黑曲霉發(fā)酵三七渣產(chǎn)淀粉酶，適量添加氮源（40～60 mg硫酸銨/g干藥渣）有利于淀粉酶的生產(chǎn)。

2.1.2 三七渣粒徑對產(chǎn)淀粉酶的影響 分別采用過 20、40、60、80、100、120 目篩的三七渣作為發(fā)酵基質，考察三七渣粒徑對產(chǎn)淀粉酶的影響，結果見圖2。

圖2 三七渣粒徑對產(chǎn)淀粉酶的影響

從圖2可見，采用過80目篩的三七渣作為發(fā)酵基質，發(fā)酵培養(yǎng)物的淀粉酶活最高。基質顆粒過大或過小都會影響產(chǎn)酶：小的物料顆?？梢蕴峁┹^大的微生物生長面積，從而提高反應速率，但是顆粒太小又容易導致物料結塊和孔隙率降低，增大傳熱和傳質阻力，影響微生物的呼吸，進而影響微生物生長和產(chǎn)酶；大顆粒物料由于存在較大的孔隙率有利于提高傳質、傳熱效率，但是只能提供較小的微生物生長面積 （Krishna和Chandrasekaran，1996；Frantisek 和 Anil，1995）。

2.1.3 含水率對產(chǎn)淀粉酶的影響 初始含水率對于微生物的增殖和酶的產(chǎn)生是一個重要的因素，含水率過高或者過低都會影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶量（Pengthamkeerati等，2012）。 含水率過低，影響營養(yǎng)物質的溶解與傳輸；含水率過高，則易使物料結塊，阻礙氣體和熱量的擴散和傳輸，都不利于菌體的生長（張福元和陳風風，2008）。本次研究考察了培養(yǎng)基初始含水率為50%～75%時對產(chǎn)淀粉酶的影響，結果見圖3。

圖3 含水率對產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖3可見，當培養(yǎng)基的初始含水率為50%～65%時，淀粉酶活隨初始含水率的增大而增大。當初始含水率達到65%時，淀粉酶活達到最大（114.4 U/g），此后隨著含水率的增加，酶活逐漸下降。采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣時，在水含量為55%時，淀粉酶活力就能達到最高 （胡偉等，2013），而 Suhad 等（2011）研究表明固體基質的含水率為40%～70%時有利于米曲霉產(chǎn)淀粉酶，這說明不同的基質和微生物對發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水率的要求是有差別的。

2.1.4 培養(yǎng)時間對產(chǎn)淀粉酶的影響 從圖4可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)3 d后淀粉酶活達到最高（113.94 U/g），之后酶活又有所下降，其酶活達到峰值的時間比采用黑曲霉單菌或黑曲霉/產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵三七渣時提前了很多，后兩者淀粉酶活達到峰值的時間分別為168 h和216 h（譚顯東等，2014；胡偉等，2013）；而采用麥麩或木薯渣和生物污泥的混合物作為培養(yǎng)基質固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的最適培養(yǎng)時間分別為5 d和2 d（Farid和Shata，2011；Pengthamkeerati等，2012）。 這也說明，發(fā)酵基質和微生物的種類對淀粉酶活到達峰值的時間影響較大。

圖4 培養(yǎng)時間對產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2 正交試驗 為了獲得最優(yōu)的培養(yǎng)工藝條件，本次研究采用L9（33）正交試驗進行相關條件的優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表1，試驗結果與方差分析分別見表2和表3。

由表3可以看出，含水率、粒徑、培養(yǎng)時間以及三者之間的交互作用對試驗結果的影響均極顯著（P＜0.01），這三個因素以及它們之間的交互作用對試驗結果影響程度的排序為：培養(yǎng)時間＞含水率＞粒徑＞交互作用。由于所考察的三個因素之間的交互作用顯著，因而需進行多重比較才能獲得最優(yōu)試驗條件組合。多重分析結果見表4。

表1 因素與水平

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

表4 正交試驗多重比較結果

由表4可以看出，試驗1和試驗6的結果最優(yōu)，兩者之間無顯著差異，考慮到生產(chǎn)成本，較優(yōu)的工藝條件搭配為試驗1（A1B1C1）。在此條件下，米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣所得發(fā)酵培養(yǎng)物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料，優(yōu)于黑曲霉發(fā)酵的結果（胡偉等，2013）。

3 結論

3.1 含水率、粒徑、培養(yǎng)時間以及三者之間的交互作用對試驗結果的影響均極顯著 （P＜0.01），這三個因素以及它們之間的交互作用對試驗結果影響程度的排序為：培養(yǎng)時間＞含水率＞粒徑＞交互作用。

3.2 在優(yōu)化的工藝條件下，即采用過60目篩的三七渣，培養(yǎng)基初始含水率60%，培養(yǎng)時間2 d，接種量10%，米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣所得發(fā)酵培養(yǎng)物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料。

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