郭素風(fēng)，楊 忠，楊繼業(yè)，張?jiān)獞c，程 景，王 曦張喜忠，王棟才，孫銳鋒，靳 光，楊效民*，（.和順縣畜牧局山西和順0700；.山西省畜牧遺傳育種中心山西太原0007；.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山西太原000）

奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離與藥敏試驗(yàn)

郭素風(fēng)1，楊 忠2，楊繼業(yè)2，張?jiān)獞c3，程 景3，王 曦3張喜忠3，王棟才3，孫銳鋒3，靳 光3，楊效民*，3
（1.和順縣畜牧局山西和順032700；2.山西省畜牧遺傳育種中心山西太原030027；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山西太原030032）

［目的］為了準(zhǔn)確高效防治牛子宮內(nèi)膜炎。［方法］對30頭病例的病原菌分離與藥敏試驗(yàn)，結(jié)果從30頭患畜子宮分泌物中分離鑒定出3種主要致病菌，其中疑似葡萄球菌14株，陽性率為46.7%（14/30）；疑似鏈球菌11株，陽性率為36.7%（11/30）；疑似大腸桿菌5株，陽性率為16.7%（5/30）。［結(jié)果］表明：恩諾沙星、卡拉霉素、諾氟沙星的抑菌效果明顯，可視為目標(biāo)場治療子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。而鏈霉素、青霉素的抑菌效果相對較差，可能與其長期使用這些藥物而產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。［結(jié)論］用藥時(shí)需合理配伍，不隨意加大劑量，同時(shí)幾種藥物交替使用，以免產(chǎn)生耐藥菌株，影響治療效果。

奶牛子宮內(nèi)膜炎；發(fā)病率；病原菌 ；藥敏試驗(yàn)；治療藥物選擇

奶牛的繁殖產(chǎn)犢是其泌乳生產(chǎn)的氣動(dòng)閥。而影響奶牛繁殖產(chǎn)犢的因素很多。目前生產(chǎn)中較為常見的奶牛子宮內(nèi)膜炎（endometritis），是造成奶牛屢配不孕、影響奶牛繁殖產(chǎn)犢率的主要因素之一。國外統(tǒng)計(jì)成年奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率平均為37%［1］，前蘇聯(lián)報(bào)道奶牛子宮炎發(fā)病率占34.9%～39.8%，以色列奶牛子宮內(nèi)膜炎的平均發(fā)病率為36.7%。子宮內(nèi)膜炎在不孕牛中所占的比例更高，Barbu等報(bào)道136頭產(chǎn)后不孕的牛中有70%患有慢性子宮內(nèi)膜炎，英國報(bào)道產(chǎn)后不孕牛中約95%患有子宮內(nèi)膜炎。瞿自明等對北京、上海、蘭州、內(nèi)蒙古等16個(gè)城市41個(gè)奶牛場的9754頭適齡奶牛調(diào)查表明，由于生殖系統(tǒng)疾病導(dǎo)致奶牛不孕占奶牛群的25.26%，其中子宮內(nèi)膜炎占68.34%。蔣兆春等對南京、徐州、無錫等13個(gè)奶牛場3759頭奶牛調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率達(dá)30.4%。另經(jīng)對8018頭母牛統(tǒng)計(jì)，子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率占7.5%，部分牛場發(fā)病率高達(dá)25%，為奶牛常發(fā)?。?］，可見子宮內(nèi)膜炎已成為影響奶牛繁殖和制約奶牛高效生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

我國的奶牛業(yè)發(fā)展較快，但起步較晚。奶牛子宮內(nèi)膜炎一直是不孕的主要原因，也對養(yǎng)殖生產(chǎn)造成較大損失，如何更好的防治奶牛子宮內(nèi)膜炎成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急?？咕帯⒅兴?、防腐消毒藥、激素和中西藥結(jié)合都可以用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎［3］。多年來獸醫(yī)工作者在奶牛子宮內(nèi)膜炎方面進(jìn)行了大量的研究工作，也取得了很大的成果。研究表明，這類疾病是由細(xì)菌、真菌、支原體、霉形體及病毒等病原微生物感染引起的，其中細(xì)菌性感染是子宮內(nèi)膜炎的主要原因之一，而金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌等是子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌。因而在治療上采用抗生素、呋喃類、碘制劑類、磺胺類、魚石脂類等藥物都有一定效果。然而不能準(zhǔn)確確定病原微生物，不得不采用廣譜抗生素或大劑量應(yīng)用抗生素類藥物，不僅投資較大，且療效一般不佳，同時(shí)或?qū)е庐a(chǎn)品中殘留，有礙于乳品安全。因此，筆者在奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治實(shí)踐中，對疑似病例的子宮分泌物并進(jìn)行微生物學(xué)的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)研究，以期進(jìn)行針對性的準(zhǔn)確高效防治，同時(shí)指導(dǎo)臨床上治療該病時(shí)的用藥選擇。

1　試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

在規(guī)模奶牛場產(chǎn)后150d以上的未孕牛群中，根據(jù)子宮內(nèi)膜炎判斷標(biāo)準(zhǔn)，累計(jì)檢測子宮內(nèi)膜炎癥狀較為明顯的患牛30頭。其中慢性卡他性子宮內(nèi)膜炎病例9頭、慢性卡他性膿性子宮內(nèi)膜炎病例16頭、慢性膿性子宮內(nèi)膜炎病例5頭。

1.2生化試劑

各類生化試劑的原輔材料均購自醫(yī)藥與生化試劑公司。按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)［5］制作各類培養(yǎng)基。

1.3藥敏紙片

受試藥物包括青霉素（PEN）、鏈霉素（STR）、恩諾沙星（ENR）、卡那霉素（KAN）、諾氟沙星（NOR）等。測定分離菌株對5種抗菌藥的敏感性。

2　試驗(yàn)方法

2.1病例分類

2.1.1慢性卡他性子宮內(nèi)膜炎 發(fā)情周期、排卵基本正常，輸精不孕。直腸檢查（子宮觸摸）形態(tài)質(zhì)地?zé)o明顯變化，陰道檢查陰道內(nèi)積有少量混濁黏液，子宮頸口開張，子宮頸陰道部略顯腫脹、充血。發(fā)情期從陰道排出混有絮狀物的黏液，子宮角略有增粗，子宮壁肥厚質(zhì)軟，彈性降低，收縮微弱。無全身癥狀，屢配不孕，判定為慢性卡他性子宮內(nèi)膜炎［2］。

2.1.2慢性卡他性膿性宮內(nèi)膜炎 發(fā)情周期紊亂，久不發(fā)情或持續(xù)發(fā)情。直腸檢查子宮叫增大，子宮壁薄厚不均、質(zhì)地較硬或松軟無彈性，卵巢上多半有持久黃體或囊腫。陰道檢查，子宮頸口開張，子宮頸陰道部充血潮紅、略有腫脹，伴有膿性分泌物。從陰道排出稀薄、污白色分泌物或膿絮，陰門下方常有灰白色膿癡粘連，判定為慢性卡他性膿性子宮內(nèi)膜炎［2］。

2.1.3慢性膿性子宮內(nèi)膜炎 發(fā)清周期不規(guī)律或不發(fā)情，躺臥時(shí)可明顯看出，從陰道中排出多量膿性分泌物，分泌物粘稠、灰白色或黃褐色，具有惡臭。直腸檢查子宮壁松軟無彈性，肥厚不均，子宮角增大［4］，兩角明顯不對稱，收縮反應(yīng)極其微弱。伴隨直檢時(shí)奶牛的努嘖從子宮經(jīng)陰道排出惡臭而濃稠的膿性分泌物。陰道檢查，子宮頸陰道部充血，腫脹，有膿性分泌物潴留。判定為慢性膿性子宮內(nèi)膜炎［2］。

2.2病料采集

對病牛采用頸枷保定，陰門處及后軀采用溫水

清洗和0.2%新潔爾滅消毒后，采用開膣器打開奶牛陰道，應(yīng)用輸精管深入子宮頸口附近抽取分泌物1～5mL，放入無菌試管中，分別編號1～30，盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定。

2.3微生物分離培養(yǎng)

2.3.1將病料分別接種于麥康凱和血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48h。

2.3.2挑取麥康凱平板上呈中等大小的單個(gè)紅色菌落，轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)。

2.3.3待肉湯變混濁后轉(zhuǎn)接營養(yǎng)瓊脂斜面37℃培養(yǎng)24～48h后染色、鏡檢、進(jìn)行生化試驗(yàn)。同時(shí)接種于伊紅美藍(lán)瓊脂觀察培養(yǎng)特性。

2.3.4挑取血液瓊脂平板上呈圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接普通肉湯，37℃培養(yǎng)。2.3.5待肉湯變混濁后轉(zhuǎn)接營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24～48h后染色、鏡檢、并進(jìn)行生化試驗(yàn)。

2.3.6挑取血液瓊脂平板上直徑0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、隆起、邊緣整齊、閃光的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接血清肉湯，37℃培養(yǎng)。

2.3.7待血清肉湯變混濁后轉(zhuǎn)接血清瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24～48h后進(jìn)行生化試驗(yàn)。

2.4鑒定標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1大腸桿菌 在麥康凱瓊脂平板上形成紅色菌落。普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h左右，肉湯變混濁。伊紅美蘭瓊脂上形成黑色帶金屬閃光的菌落。營養(yǎng)瓊脂斜面染色、鏡檢，呈革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌。

2.4.2葡萄球菌 血液瓊脂平板上形成菌落較大，圓形，隆起，邊緣整齊，表面光滑，菌落周圍產(chǎn)生透明溶血環(huán)。肉湯培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長。營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24～48h后染色、鏡檢，呈革蘭氏陽性、葡萄串狀、成雙或單個(gè)排列。

2.4.3鏈球菌 普通瓊脂中生長不良，在鮮血瓊脂培養(yǎng)中形成淡灰色半透明、隆起閃光的露滴狀小菌落，呈αβ或γ型溶血。血清瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24～48h后染色、鏡檢、呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。

2.5細(xì)菌生化試驗(yàn)

2.5.1大腸桿菌 發(fā)酵試驗(yàn)：三糖鐵、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)：陽性；V-P試驗(yàn)，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)：陰性，不產(chǎn)生H2S。

2.5.2葡萄球菌 血液凝固酶試驗(yàn)：陽性；發(fā)酵試驗(yàn)：甘露醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，蔗糖部分產(chǎn)酸；溶血性試驗(yàn)：形成溶血環(huán)。

2.5.3鏈球菌 淀粉、七葉苷等發(fā)酵試驗(yàn)：陽性；馬尿酸鹽、明膠水解試驗(yàn)：陰性；精氨酸水解試驗(yàn)：陽性。

2.6藥敏試驗(yàn)

2.6.1試驗(yàn)方法 將分離鑒定的大腸桿菌和葡萄球菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基，鏈球菌接種于血清湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，適當(dāng)稀釋后吸取150μL加到普通瓊脂（大腸桿菌和葡萄球菌）和血清瓊脂（鏈球菌）平板內(nèi)，用“T”形涂布棒涂勻，再用無菌鑷子將5種藥敏紙片分別貼到平板上，37℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑。

2.6.2判斷標(biāo)準(zhǔn) 抑菌圈直徑（包含紙片的直徑）用游標(biāo)卡尺測量。根據(jù)被測定藥物按常用劑量給藥時(shí)在體內(nèi)能達(dá)到的血藥濃度而將敏感性標(biāo)準(zhǔn)分為3級：高度敏感 （sensitive，S）、中 度敏感（intermediate，I）和耐藥（resistant，R）［6］。抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，10～15mm為中度敏感，15mm以上為高度敏感［7］。

3　結(jié)果與分析

3.1細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

通過鏡檢，并根據(jù)鑒別培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，從30頭患畜子宮分泌物中初步分離鑒定出3種主要致病菌，其中共分離到14株疑似葡萄球菌，陽性率為46.7% （14/30）；11株疑似鏈球菌，陽性率為36.7%（11/ 30）；5株疑似大腸桿菌，陽性率為16.7%（5/30）。其中感染一種細(xì)菌的21例，感染兩種細(xì)菌的3例，感染3種細(xì)菌的2例。證明該病混合感染較少。

3.2細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

各菌屬生化鑒定結(jié)果均滿足該菌屬生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)了分離鑒定的結(jié)果。

3.3藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各類病原菌對青霉素、鏈霉素、恩若沙星、卡那霉素、諾氟沙星等抗生素藥物敏感性列于表1。

表1　病原菌對五種藥物敏感性對比表

3.4抑菌效果分析

從表1中明顯看出，葡萄球菌對5類抗生素藥物均高度敏感，特別是恩諾沙星的抑菌圈直徑達(dá)30毫米，依次為卡拉霉素、諾氟沙星、鏈霉素和青霉素，抑菌圈直徑分別為29mm、26mm、25mm和18mm；鏈球菌對5種藥物中的恩諾沙星、諾氟沙星、卡拉霉素和青霉素高度敏感，抑菌圈直徑依次為31mm、29mm、27mm和18mm，而鏈球菌對鏈霉素為中度敏感，抑菌圈直徑為14mm；大腸桿菌對諾氟沙星、卡拉霉素和恩諾沙星高度敏感，抑菌圈直徑依次為22mm、20mm和19mm，而對鏈霉素中度敏感，抑菌圈直徑13mm，對青霉素則具有耐藥性，抑菌圈直徑僅為9mm。亦即青霉素對葡萄球菌和鏈球菌具有一定抑制作用，而對大腸桿菌的抑制作用較弱；鏈霉素對葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，對鏈球菌和大腸桿菌也有一定抑制作用；恩諾沙星、卡拉霉素和諾氟沙星對葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌均有高度抑制作用。

4　討論與建議

4.1主要病原與病因

奶牛子宮內(nèi)膜炎的病因比較復(fù)雜，細(xì)菌感染是其中主要的原因。該病多繼發(fā)于分娩異常及子宮的其他疾病如子宮炎、子宮積膿、產(chǎn)道損傷等。產(chǎn)后處理不當(dāng)或處理不及時(shí)可引起繼發(fā)感染［8］；胎衣不下或剝離不徹底，滯留部分變性壞死，由病原微生物侵入造成化膿性炎癥，引起膿性子宮內(nèi)膜炎。引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、化膿性棒狀桿菌、支原體等［9］，而不同地區(qū)病原菌類型不同［10］，本試驗(yàn)的細(xì)菌分離結(jié)果也表明，葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌為該病的主要致病菌。

4.2治療藥物選擇與應(yīng)用

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星、卡那霉素、諾氟沙星對幾種試驗(yàn)菌均高度敏感，可作為奶牛場治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。鏈霉素、青霉素等的抑菌效果較差，可能與其長期使用這些藥物而產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。因此用藥時(shí)需合理配伍，不隨意加大劑量，同時(shí)幾種藥物交替使用，以免產(chǎn)生耐藥菌株。

4.3以防為主，防重于治

奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生也與人為因素、營養(yǎng)和管理因素密切有關(guān)。強(qiáng)化母牛飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力［11］是預(yù)防其發(fā)生的重要技術(shù)措施。首先是通過營養(yǎng)調(diào)控，維護(hù)奶牛正常繁殖體況，體況評分控制在30～3.5分。其次要規(guī)范化助產(chǎn)，目前部分牛場存在過度助產(chǎn)問題，主要是過早助產(chǎn)或助產(chǎn)時(shí)消毒不嚴(yán)、助產(chǎn)粗魯［2］，另外，配種時(shí)消毒不嚴(yán)或操作過程不細(xì)，損傷子宮頸粘膜，過度地增加輸精次數(shù)［2］，值得強(qiáng)調(diào)的是，部分授精員認(rèn)為輸精部位越深受胎率越高，因而把精液直接輸?shù)阶訉m角，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷，筆者建議，通常情況下，應(yīng)嚴(yán)格直腸把握子宮頸深部輸精的技術(shù)操作規(guī)程，把精液輸?shù)阶訉m頸深部，也是預(yù)防子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的重要技術(shù)措施之一。

［1］ 陳家璞.乳牛疾病學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：270-278.

［2］ 肖定漢，奶牛病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社2012：326-328.

［3］ 許臘梅，馮萬宇，王巖.奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（8）71-74，96.

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［10］吳明樓，劉士喜，蘇輝，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎分泌物病原菌和病理學(xué)探討［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31（1）：106-107.

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Identification and Drug Sensitivity Test of the Pathogenic Microbe of Dairy Cattle Endometritis

GUO Su-feng1，YANG Zhong2，YANG Ji-ye2，ZHANG Yuan-qing2，CHENG Jing3，WANG Xi3， ZHANG Xi-zhong3，WANG Dong-cai3，SUN Rui-feng3，JIN Guang3，YANG Xiao-min*3
（1.Heshun Animal Husbandry Bureau，Heshun Shanxi 032700； 2.The livestock breeding Center in Shanxi province，Taiyuan，Shanxi，030027，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi，030032，China）

【Objective】Cattle endometritis is a common and frequently-occurring disease，which majorly affects the conception rate in dairy cattle farm.The objective of this study is to prevent and cure cattle endometritis accurately and efficiently.【Method】Pathogens were separated from 30dairy cattle that suffered from endometritis and were analyzed by medicine sensitive test.The results showed that the uterine secretion derived pathogens included three major kinds of bacterias：14strains of suspected Staphylococcus aureus（ positive rate is 46.7％），11strains of suspected Streptococcus（positive rate is 36.7％），5strains of suspected Escherichia coli（positive rate is 16.7％）.【Result】Based on the medicine sensitive test，it showed that enrofloxacin，kalamycin，norfloxacin may observably inhibit the growth and proliferation of pathogens and may be the primary candidate for endometritis therapy in dairy cattle farm.However，the pathogens were insensitive to streptomycin and penicillin.It suggested that drug-resistant generated and may due to long-term use of these antibiotics.【Conclusion】As a conclusion，to avoid drug-resistant and maximize the therapeutic efficacy，compatibility of medicines should be applied in a reasonable ratio and the dosage should be controlled and should not be increased casually.Meanwhile，different kinds of medicine should be used alternately.

endometritis of dairy cattle；morbidity；pathogenic microbe；drug sensitivity test；selected of therapy drugs

S858.237.2+2

A

1001-9111（2015）

2015-06-20 修改日期：2015-07-10

“十二五”國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）子課題（2011AA100307-05）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng)（201503134）；動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2004DA125184F1028）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311024-2、20120311021-1）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種工程項(xiàng)目（11yzgc017）

郭素風(fēng)（1973-），女，山西和順人，主要從事動(dòng)物疫病防治工作E-mail：1050033020@qq.com。

楊效民，（1956-）男，山西芮城人，研究員，從事養(yǎng)牛生產(chǎn)科學(xué)研究，E-mail：18635135676@126.com.