毛　祥，黃　丹*，沈才萍，何開萍，鐘方達，胡　峰（.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 64000；.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；.貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 5646）

醬香型大曲中產(chǎn)淀粉酶菌的分離鑒定及發(fā)酵特性研究

毛祥1，黃丹1*，沈才萍2，何開萍3，鐘方達3，胡峰3
（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

對醬香型大曲中高產(chǎn)淀粉酶菌株進行分離鑒定，并對其產(chǎn)酶條件和代謝產(chǎn)物進行研究。結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)和16S rDNA同源序列分析對篩選獲得的醬香型大曲中高產(chǎn)淀粉酶菌株進行鑒定，以小麥、麩皮浸提液為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，研究培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值、搖床轉(zhuǎn)速對其產(chǎn)淀粉酶能力的影響。結(jié)果顯示，該分離菌株為枯草芽孢桿菌（Baci11us Subti1is），產(chǎn)酶最適條件為：培養(yǎng)溫度50℃、初始pH值6.0、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，其酶活力達8 667.79 U/mL。

醬香型大曲；淀粉酶；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵條件；代謝產(chǎn)物

中國傳統(tǒng)白酒被稱為世界六大蒸餾酒之一，其中醬香型白酒占有舉足輕重的地位。醬香型白酒生產(chǎn)工藝獨特，其中很重要的一點就是用曲量大，醬香型白酒釀造過程中，大曲用量占到釀酒原料的85%～95%，因此大曲質(zhì)量與醬酒風(fēng)味密切相關(guān)。醬香型大曲中有著種類繁多的酶系，它們可以將大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)被微生物所利用，有些會直接參與特有的風(fēng)味物質(zhì)形成，可見大曲酶系對釀酒的出酒率和成品的質(zhì)量都有很大的影響［1-2］。淀粉酶降解制曲原料所產(chǎn)生的小分子糖類物質(zhì)不僅是釀酒過程中各種微生物生長繁殖所需的碳源，而且小分子物質(zhì)之間也會發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)從而生成多種風(fēng)味成分?？梢姷矸勖富盍ψ鳛闈庀阈痛笄囊粋€重要質(zhì)量指標(biāo)，不僅跟淀粉質(zhì)原料的水解程度有關(guān)，而且跟一些風(fēng)味物質(zhì)的合成密切相關(guān)，目前對醬香型大曲產(chǎn)淀粉酶菌株的研究，也大多局限于產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選，淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)以及淀粉酶產(chǎn)生菌株發(fā)酵特性的研究等方面［3-5］。因此，本研究將從醬香型大曲中篩選得到一株高產(chǎn)淀粉酶的耐高溫菌株，并優(yōu)化產(chǎn)酶條件，在最佳產(chǎn)酶條件下，探究淀粉酶酶活與代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系。本研究了解淀粉酶產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物與菌株淀粉酶活力的相關(guān)性，有助于揭示醬香的形成機制，對提高醬香白酒品質(zhì)具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬香型大曲：某著名醬香型酒廠提供。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，NaC1 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，可溶性淀粉5 g，水1 000 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基按小麥∶麩皮∶水比例為4∶1∶40，于60℃浸潤6 h，5 000 r/min離心15 min，取其上清液121℃高溫濕熱滅菌20 min。

蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；可溶性淀粉、氯化鈉、三氯乙酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecy1 su1fate，SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecy1 trimethy1 ammoniumbromide，CTAB）：上海索萊寶生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（po1ymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒：寶生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

H752紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；7890A GC/MS：美國安捷倫公司；HITACHI CR22G高速離心機：日本HITACHI公司；C9000 PCR儀：美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1醬香型大曲中淀粉酶產(chǎn)生菌的分離

稱取25 g碾碎的大曲樣品，加入至含有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，37℃、225 r/min振蕩1 h。按稀釋平板法將10-4、10-5、10-6三個稀釋梯度樣品處理液涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)1 d，滴加碘液，觀察產(chǎn)淀粉酶菌株菌落周圍的透明圈，并測量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比。選擇D/d值大的菌株進行純化，純化后，接種試管斜面低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2醬香型大曲中淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選［6］

分離菌株的形態(tài)鑒定：觀察各菌株菌落的形態(tài)、顏色以及菌落大小，并通過革蘭氏染色和芽孢染色觀察其個體形態(tài)，對篩選菌株進行初步的鑒定。

分離菌株的16S rDNA序列同源性分析鑒定：菌株16S rDNA提?。喝?.0 mL的培養(yǎng)菌液12 000 r/min離心1 min；沉淀物加入500 μL的TE緩沖液重懸，加入30 μL 10%的SDS 65℃溫浴1 h，再置于-80℃超低溫冰箱放置15 min，后將離心管轉(zhuǎn)移到65℃水浴鍋放置15 min，如此重復(fù)3次，以促進細胞破裂。再于4℃、6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到2mL離心管中，加等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），劇烈振蕩5 min，靜置10 min后，13 000 r/min離心20 min。后將上層水相移入新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h，13 000 r/min，離心20 min，棄上清，可見黑褐色沉淀。去除殘余的異丙醇液體，加入1 000 μL體積分數(shù)70%乙醇，并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管內(nèi)，靜置10 min，4℃、13 000 r/min離心15 min，棄上清液，去除殘余的乙醇液體，置于超凈臺吹風(fēng)10 min，除盡乙醇，再入100 μL無菌水，置65℃水浴鍋水浴1 h，促進DNA的溶解。

16S rDNA的PCR擴增及測序：PCR反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL 10×buffer，3 μL MgC12（25 mmo1/L），4 μL dNTPs （2.5 mmo1/L），1 μL引物Ⅰ（10 μmo1/L），1 μL引物Ⅱ（10 μmo1/L），1 μLTaq酶（5 U/μL），1 μL模板（100 mg/L），34 μL ddH2O。引物UP-1為GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，引物UP-2S為AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT，PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min后進入35次循環(huán)94℃、1min，53℃、1min，72℃90s，72℃延伸10min。

數(shù)據(jù)分析：將擴增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和確定其分類地位。DNA MAN軟件對齊序列，Mega6.0軟件的鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3醬香型大曲中淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件研究

淀粉酶活性測定方法按照參考文獻［7］：反應(yīng)體系為5 mL 0.5%淀粉液中加入0.5 mL淀粉酶，在pH 6.0、40℃反應(yīng)20min，加0.4 mo1/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，取0.5 mL反應(yīng)液，加入5 mL 0.4 mmo1/L盧戈氏碘液（KI-I2）溶液顯色，波長620nm處測定光密度值。1個活力單位定義為20 min內(nèi)水解1 mL淀粉液的酶量（U）。

不同培養(yǎng)條件對淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶能力的影響：50 mL液體培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min，種子液接種量5%（V/V），培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心發(fā)酵液10 min獲得上清液，即粗淀粉酶液。培養(yǎng)溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃（自然pH、160 r/min），培養(yǎng)基初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（50℃、160 r/min），搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min（pH 6.0、50℃）。

2　結(jié)果與分析

2.1醬香型大曲中高產(chǎn)淀粉酶菌株的分離篩選

用篩選培養(yǎng)基對產(chǎn)淀粉酶細菌進行稀釋涂布分離，培養(yǎng)36 h后取出平板培養(yǎng)物滴加盧氏碘液，靜置5 min待染色充分后，觀察各菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小，并測量D/d之比，初步判斷該菌株產(chǎn)淀粉酶能力的強弱。挑選5株D/d比值大且菌落直徑也比較大的菌落，分別編號為1#、2#、3#、4#、5#。對初篩得到的5株菌在37℃、160 r/min條件下產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，分別測定其酶活力，進行復(fù)篩。菌株的篩選結(jié)果如表1所示。

由表1可知，1#菌株的酶活最大為6 004.50 U/mL。后續(xù)實驗將選取產(chǎn)淀粉酶能力最強的1#菌為目的菌株。

各產(chǎn)淀粉酶菌株的菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，質(zhì)地疏松，乳白色，較濕潤，表面光滑易挑取，邊緣整齊。再對1#菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色，可知菌株呈桿狀，有芽孢產(chǎn)生，革蘭氏陽性菌，初步判斷為革蘭氏陽性芽孢桿菌［9］。

表1　菌落的初篩和復(fù)篩測定結(jié)果Table 1 Determination results of preliminarily screening and second screening

2.2菌株16S r DNA序列同源性分析鑒定［3］

提取1號菌株的16S rDNA，并通過PCR擴增和基因測序得知其序列，在將其擴增基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbor-Joining法計算，Boottrap值為1 000次。如圖1所示，1#菌株與Baci11us subti1is親緣關(guān)系最近，相似度達99%，故1#菌株屬于枯草芽孢桿菌，命名Baci11us subti1isHD-1。

圖1　1#菌株基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene of strain1#

圖3　初始pH值對菌株產(chǎn)酶能力的影響Fig.3 Effect of initial pH on enzyme activity

2.3淀粉酶產(chǎn)生菌最適產(chǎn)酶條件研究

2.3.1培養(yǎng)溫度對產(chǎn)淀粉酶菌株產(chǎn)酶的影響

圖2　培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶能力的影響Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme activity

圖4　搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶能力的影響Fig.4 Effect of different rotation speed on enzyme activity

培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶能力的影響如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)溫度為30～50℃時，菌株代謝的酶活力隨著溫度的增加而增大；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于50℃時，淀粉酶活力隨著培養(yǎng)溫度的升高而降低，這可能是高溫抑制了菌體的生長繁殖，影響淀粉酶的產(chǎn)量，從而導(dǎo)致酶活力的降低。當(dāng)培養(yǎng)溫度為50℃時，該枯草芽孢桿菌的產(chǎn)淀粉酶活力最高，達7 536.43 U/mL?？梢姡珺aci11us subti1isHD-1菌株產(chǎn)酶的最適溫度為50℃。

2.3.2培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)淀粉酶菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶能力的影響如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)基pH在5.0～6.0時，1#菌株產(chǎn)生的淀粉酶的活力隨pH的增加而增大，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH＞6.0時，1#菌株產(chǎn)生的淀粉酶的活力隨pH的增加而增大而減小，因為培養(yǎng)環(huán)境的pH值對微生物生命活動的影響很大，主要是pH條件引起細胞膜兩側(cè)的電位變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在初始pH值為6.0時，產(chǎn)淀粉酶活力最高，達8 143.98 U/mL。因此，Baci11us subti1isHD-1菌株產(chǎn)酶的最適初始pH值為6.0。

2.3.3轉(zhuǎn)速對產(chǎn)淀粉酶菌株產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶能力的影響如圖4所示。由圖4可知，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min增至180 r/min時，該菌株的產(chǎn)酶能力逐漸增加。由于氧在水中的溶解度很低，增加搖床轉(zhuǎn)速有利于增加水中氧的含量，從而增加菌株的繁殖和代謝，產(chǎn)酶能力增加。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速＞180 r/min后，該菌株產(chǎn)酶能力隨搖床轉(zhuǎn)速的增加而減小，可能是由于水中過多的氧氣容易形成超氧化物基O2-和過氧化物基O22-，破壞細胞及細胞膜，影響菌體的生長繁殖從而降低菌株產(chǎn)酶能力。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180r/min時，菌株產(chǎn)淀粉酶的酶活力最高，達8667.79U/mL?？梢?，Baci11us subti1isHD-1菌株產(chǎn)酶的最適搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

3　結(jié)論

通過稀釋平板法和平皿生化反應(yīng)從醬香型大曲中分離篩選出產(chǎn)淀粉酶能力較強的5株菌株，再通過發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)對挑選的5菌株進行發(fā)酵復(fù)篩，獲得一株高產(chǎn)淀粉酶菌株，其酶活力達6 004.50 U/mL。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA同源序列的鑒定，此菌株屬于枯草芽孢桿菌（Baci11us subti1is）。

研究發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH值、供氧量對此菌株產(chǎn)淀粉酶能力的影響，最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度50℃、初始pH6.0、轉(zhuǎn)速180 r/min，在此條件下菌株產(chǎn)淀粉酶的酶活力達8 667.79 U/mL。

［1］袁先鈴，黃丹，劉達玉，等.醬香型大曲中蛋白酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件研究［J］.中國釀造，2012，31（6）：34-37.

［2］楊國華，邱樹毅，黃永光.醬香白酒生產(chǎn)中產(chǎn)香微生物研究［J］.中國釀造，2011，30（4）：24-27.

［3］明紅梅，劉宇馳，卓毓崇，等.制曲溫度對醬香型大曲質(zhì)量的影響［J］.中國釀造，2010，29（7）：157-160.

［4］張應(yīng)蓮，黃永光，邱樹毅.醬香大曲中白地霉產(chǎn)蛋白酶固態(tài)發(fā)酵條件及其優(yōu)化［J］.中國釀造，2012，31（3）：35-38.

［5］徐瑾，廖永紅，徐嘉良，等.應(yīng)用PCR技術(shù)分析釀酒微生物群落的研究展望［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，36（2）：248-253.

［6］謝建華，師永生，杜麗琴，等.一株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的篩選、純化及酶學(xué)性質(zhì)［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011（1）：95-99.

［7］史永昶，姜涌明.五種α-淀粉酶測活方法的比較研究［J］.微生物學(xué)通報，1996（6）：371-375.

［8］蔣麗婷，李理.HS-SPME結(jié)合GC-MS測定白腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味成分［J］.中國釀造，2011，30（3）：150-155.

［9］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗［M］.北京：高等教育出版社，2013.

［10］朱玉賢，李毅，等.現(xiàn)代分子生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［11］范文來，徐巖.醬香型白酒中呈醬香物質(zhì)研究的回顧與展望［J］.釀酒，2012（3）：8-16.

［12］ZHU B F，XU Y.A feeding strategy for tetramethy1pyrazine production byBaci11us subti1isbased on the stimu1ating effect of ammonium phosphate［J］.Bioproc Biosyst Eng，2010，33（8）:953.

［13］ZHU B F，XU Y，F(xiàn)AN W L，et a1.High-yie1d fermentative preparation of tetramethy1pyrazine byBaci11ussp.using an endogenous precursor approach［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（2）:179-186.

［14］明紅梅，余歡，周健，等.大曲中產(chǎn)香兼性厭氧細菌的篩選及揮發(fā)性成分分析［J］.食品與機械，2015（2）：7-10.

［15］趙德義，湯丹丹，曹建全，等.產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌株的選育［J］.中國釀造，2015，34（3）：102-106.

Iso1ation，identification and fermentation characteristics of amy1ase-producing strain from Moutai-f1avor Daqu

MAO Xiang1，HUANG Dan1*，SHEN Caiping2，HE Kaiping3，ZHONG Fangda3，HU Feng3
（1.Co11ege of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China；2.Luzhou Laojiao Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China；3.Guizhou Xijiu Co.，Ltd.，Xishui 564622，China）

The strain with high amy1ase-producing abi1ity were iso1ated from Moutai-f1avor Daqu，and the amy1ase-producing condition and metabo-1ites were studied.Combining with morpho1ogica1 indexes and 16S rDNA homo1ogous sequence ana1ysis，the iso1ated strain was identified.Using wheat and wheat bran extract as 1iquid fermentation medium，the effect of fermentation temperature，medium pH and rotation speed on amy1ase production capacity was studied.The resu1ts showed that the strain was identified asBaci11us subti1is，and the enzyme activity cou1d reach 8 667.79 U/m1 when the fermentation temperature was conducted at 40℃with pH va1ue of 6.0，rotation speed 180 r/min.

Moutai-f1avor Daqu；amy1ases；Baci11us subti1is；1iquid fermentation；metabo1ites

TS261.1

A

0254-5071（2015）12-0024-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.006

2015-10-26

四川省教育廳重點1項目（3ZA0124）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室項目（NJ2013-02）；瀘州老窖科研獎學(xué)金項目（151jzk02）；四川理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項目（y2014023）

毛祥（1989-），男，碩士研究生，研究方向為食品發(fā)酵生物技術(shù)。

黃丹（1968-），女，教授，本科，主要從事食品工程方面的教學(xué)和研究工作。