王強強　莫海飛　楊玉玲等

摘要：采用單因素試驗和響應(yīng)面法對里氏木霉（Trichoderma reesei） RutC-30產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化并以濾紙酶活力（FPA）作為響應(yīng)值。結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵條件為玉米芯粉3.42%，牛肉膏添加量1.70%，吐溫-80添加量0.08%，初始pH 5.04，此條件下發(fā)酵液中的濾紙酶活力為12.10 U/mL，較未優(yōu)化條件下得到的最高酶活力7.03 U/mL提高了72.12%。

關(guān)鍵詞：里氏木霉（Trichoderma reesei）；玉米芯粉；纖維素酶；酶活；液體發(fā)酵；響應(yīng)面

中圖分類號：TQ925 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3735-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.040

Abstract： Single-factor tests and response surface methodology， with filter paper activity （FPA） as response value， were used to optimize the liquid-state fermentation medium for cellulase production by Trichoderma reesei RutC-30.The results showed that the optimum medium was composed of corncob powder 3.42%，beef extract 1.70%，and Tween-80 0.08% with initial pH 5.04. Under this condition，the FPA reached to 12.10 U/mL and increased by 72.12%，compared with the maximum FPA （7.03 U/mL） before optimization.

Key words：Trichoderma reesei；corncob powder；cellulase；enzyme activity；liquid-state fermentation；response surface methodology

植物纖維素類資源被統(tǒng)稱為生物質(zhì)資源，主要包括農(nóng)林、固體及能源作物廢棄物，其中農(nóng)林廢棄物（如麥稈、麩皮、玉米秸稈、玉米芯、甘蔗渣、森林采伐加工剩余物等）中含有最豐富的纖維素類可再生資源[1-4]。中國是玉米種植第二大國，且在糧食作物總產(chǎn)量中占有很大比例[5-7]。玉米芯中含有豐富的營養(yǎng)成分，但因其適口性和營養(yǎng)性差，在飼料行業(yè)中未能得到有效的利用，隨著科技不斷更新，玉米芯諸多潛在功能與價值逐漸被開發(fā)出來[8]。玉米芯資源價格低廉，其綜合利用可以緩解因燃燒而引起的環(huán)境污染問題，具有不可估量的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益與社會效益[8-11]。本試驗利用纖維素酶工業(yè)高產(chǎn)絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）[12]，采用液體發(fā)酵的方式，以玉米芯粉為發(fā)酵底物對產(chǎn)纖維素酶條件進行優(yōu)化，以期為玉米芯粉更好地產(chǎn)纖維素酶利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 里氏木霉RutC-30，由中國科學(xué)院微生物研究所提供。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 GSKP-01BII型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；MaxQ搖床、ST16R臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；UV-6100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Delta-320型pH計，瑞士Mettler-Toledo有限公司。

1.1.3 主要材料與試劑 玉米芯粉：取玉米田地中自然風(fēng)干的玉米芯鍘成小塊烘干，用粉碎機粉碎后過篩（1.0 mm）；吐溫-80：分析純，成都康迪生物技術(shù)有限公司；0.05 mol/L、pH 4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，DNS試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA斜面；MM培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，硫酸銨5.0 g，KH2PO4 15 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2 0.45 g，CoCl2·6H20 3.7 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O 1.4 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，加去離子水至1 000 mL，pH自然；基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：將MM培養(yǎng)基中葡萄糖等量換成微晶纖維素即可。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與擴大培養(yǎng) 將冷藏菌接種在新鮮PDA平板上，30 ℃活化培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后，取1 mL 1×107個/mL的孢子懸液接入裝有50 mL MM培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，待產(chǎn)菌絲。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)及粗酶液提取 2層紗布過濾菌絲并稱取1 g（濕重）菌絲，接種到50 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。

1.2.3 酶活力測定 濾紙酶活力（Filter Paper Activity，F(xiàn)PA）測定[13]：將新華濾紙裁成6 cm×1 cm的長方形，卷成圓筒狀置于試管底部，加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液1.8 mL，50 ℃預(yù)熱5 min，再加入稀釋酶液0.2 mL（空白對照加等體積滅活酶液），50 ℃水浴保溫60 min后，迅速冷卻。加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min后迅速冷卻，補加去離子水至25 mL，搖勻靜置，于540 nm處測定吸光值。

酶活定義：在試驗條件下，1 mL酶液1 min水解底物生成1 μg還原糖（以葡萄糖計）所需酶量為一個酶活力單位（U/mL）。endprint

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 ①單因素試驗。保持其他因素不變，考察碳源（玉米芯粉、麩皮、微晶纖維素、乳糖、甘油、葡萄糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、尿素、硝酸鈉）、吐溫-80添加量、產(chǎn)酶初始pH以及氮源與碳源添加量對里氏木霉RutC-30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力的影響。②響應(yīng)面優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計4因素3水平試驗，響應(yīng)面分析優(yōu)化里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件，并進行最優(yōu)驗證試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最優(yōu)碳源及其最適添加量 在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加2.0%的不同碳源并測定其FPA，結(jié)果（圖1）表明，玉米芯粉、麩皮對里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶都有明顯的誘導(dǎo)效果，其中玉米芯粉效果最佳。因此選取玉米芯粉為碳源，考察玉米芯粉不同添加量（m/V，g：mL，下同）對里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)玉米芯粉添加量為3.5%時，發(fā)酵液中的FPA最高。

2.1.2 最優(yōu)氮源及其最適添加量 向基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加0.5%的氮源，測定發(fā)酵液中纖維素酶活力。結(jié)果（圖3）表明，有機氮源較無機氮源對里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶有更好的效果，其中牛肉膏對產(chǎn)酶效果最佳。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中依次加入不同量牛肉膏，確定牛肉膏的最適添加量（m/V，g：mL，下同），結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)牛肉膏添加量為2.0%時，發(fā)酵液中FPA最高。

2.1.3 最優(yōu)吐溫-80添加量 在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的吐溫-80，測定其對里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)吐溫-80添加量（m/V，g：mL，下同）較少時，發(fā)酵液中纖維素酶活力逐漸增高，當(dāng)添加量為0.12%時，發(fā)酵液中的FPA最高，較未添加條件下酶活力提高了48.46%，繼續(xù)增加吐溫-80酶活力反而下降。

2.1.4 最優(yōu)產(chǎn)酶初始pH 設(shè)定其他因素不變，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH并檢測不同pH條件下發(fā)酵液中纖維素酶活力，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH為5.0時，發(fā)酵液中纖維素酶活力最高。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計4因素3水平試驗，因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

2.2.2 數(shù)學(xué)模型建立及顯著性檢驗分析 根據(jù)Design Expert 8.0.5b軟件對表2中試驗結(jié)果進行二次線性回歸方程擬合，得到數(shù)學(xué)模型：Y=14.51-1.53A-2.61B-0.40C+0.58D-3.31AB+3.12AC-0.68AD+1.30BC+2.04BD-1.55CD-4.38A2-1.51B2-1.05C2-1.38D2。

由表3可知，模型顯著（P<0.05）， 因變量與自變量間線性關(guān)系較好（R2=0.789 1），模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.543 0，失擬項P=0.928 7>0.05，說明模型擬合程度較好且失擬不顯著，預(yù)測值與實際值間具有高度的相關(guān)性。由響應(yīng)面分析F可知，各因素對里氏木霉RutC-30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力影響的主次順序為牛肉膏、玉米芯粉、初始pH、吐溫-80。

2.2.3 培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化與分析 利用Design Expert 8.0.5b軟件對數(shù)據(jù)進行分析得到響應(yīng)面及等高線圖，各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響可直觀地反映出來。其中等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素間的交互作用顯著，相反，圓形則表示不顯著[14，15]。具體響應(yīng)面優(yōu)化分析見圖7-圖12。由圖7可知，設(shè)定吐溫-80添加量及初始pH均為最優(yōu)水平。當(dāng)玉米芯粉加入量為某一值時，牛肉膏添加量為1.70%時FPA最高；當(dāng)牛肉膏添加量為某一值時，隨著玉米芯粉添加量的逐漸增加，F(xiàn)PA呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。由等高線圖可知，兩因素交互作用明顯且達到顯著水平（P=0.032 6）。再由等高線變化密集度可知，玉米芯粉添加量對FPA的影響強于牛肉膏添加量。

由圖8可知，設(shè)定牛肉膏添加量及初始pH均為最優(yōu)水平。當(dāng)玉米芯粉加入量為某一值時，隨著吐溫-80添加量的逐漸增加，F(xiàn)PA逐漸增高，當(dāng)其添加量為0.08%時，F(xiàn)PA最高；當(dāng)吐溫-80添加量一定時，F(xiàn)PA隨著玉米芯粉添加量的逐漸增加而出現(xiàn)先增高后降低的趨勢。由等高線圖可知，玉米芯粉添加量與吐溫添加量交互作用明顯且達到顯著水平（P=0.041 8）。再由等高線變化密集度可知，玉米芯粉添加量對FPA的影響強于吐溫-80。

由圖9可知，設(shè)定牛肉膏添加量及吐溫-80添加量均為最優(yōu)水平。當(dāng)玉米芯粉添加量為某一值時，隨著初始pH的逐漸增加，F(xiàn)PA呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；當(dāng)初始pH為某一值時，隨著玉米芯粉添加量的逐漸增加，F(xiàn)PA也出現(xiàn)先增高后降低的趨勢。由等高線圖中等高線形似圓形，表明玉米芯粉添加量與初始pH交互作用明顯但未達到顯著水平（P=0.631 3）。由等高線圖等高線變化密集度可知，玉米芯粉添加量對FPA的影響強于初始pH。

由圖10可知，設(shè)定玉米芯粉添加量及初始pH均為最優(yōu)水平。當(dāng)牛肉膏添加量為某一值時，吐溫-80添加量為0.08%時，F(xiàn)PA最高；當(dāng)吐溫-80添加量為某一值時，隨著牛肉膏添加量的逐漸增加，F(xiàn)PA逐漸降低，加入1.70%牛肉膏時，F(xiàn)PA最高。由等高線圖可知，牛肉膏添加量與吐溫-80添加量交互作用明顯但未達到顯著水平（P=0.352 0）。由等高線圖等高線變化密集度可知，牛肉膏添加量對FPA的影響強于吐溫-80添加量。

由圖11可知，設(shè)定玉米芯粉添加量及吐溫-80添加量均為最優(yōu)水平。當(dāng)牛肉膏添加量為某一值時，隨著初始pH的逐漸增加，F(xiàn)PA呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；當(dāng)初始pH為某一值時，隨著牛肉膏添加量的逐漸增加，F(xiàn)PA逐漸降低，牛肉膏添加量為1.70%時，F(xiàn)PA最高。由等高線圖可知，牛肉膏添加量與吐溫-80添加量交互作用明顯但未達到顯著水平（P=0.162 5）。由等高線圖等高線變化密集度可知，牛肉膏添加量對FPA的影響強于初始pH。endprint

由圖12可知，設(shè)定玉米芯粉添加量及牛肉膏添加量均為最優(yōu)水平。當(dāng)吐溫-80添加量為某一值時，F(xiàn)PA隨著初始pH的逐漸增加而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；當(dāng)初始pH為某一值時，吐溫-80添加量為0.08%時，F(xiàn)PA最高。由等高線圖可知，吐溫-80添加量與初始pH交互作用明顯但未達到顯著水平（P=0.281 0）。由等高線圖等高線變化密集度可知，初始pH對FPA的影響強于吐溫-80添加量。

2.2.4 最優(yōu)發(fā)酵條件驗證結(jié)果 由Design Expert 8.0.5b軟件分析可知最優(yōu)發(fā)酵條件為玉米芯粉3.42%、牛肉膏添加量1.70%、吐溫-80添加量0.08%、pH 5.04時，預(yù)測FPA最高為16.40 U/mL。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準確性，依據(jù)響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成進行驗證試驗，得到FPA為12.10 U/mL，較未優(yōu)化的條件得到的最高酶活力7.03 U/mL提高了72.12%，與模型預(yù)測值符合度為73.78%。

3 結(jié)論

相比于固體發(fā)酵，液體發(fā)酵更適合于工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)[11]。本試驗中利用農(nóng)田地里自然風(fēng)干的玉米芯，經(jīng)過粉碎制得玉米芯粉后直接用于試驗研究，并得到了較好的試驗效果，減少了因?qū)τ衩仔厩疤幚矶鴰淼馁Y源及成本的浪費[12]。

吐溫-80是一種良好的細胞表面活性劑，因能改變細胞膜的通透性而有效促進胞內(nèi)蛋白的釋放[16]。劉佳等[17]添加臨界膠束濃度的吐溫-80后使酶活提高了31.8%；王亞林等[18]使用土溫-80后FPA提高了29.6%；本試驗中添加0.12%吐溫-80時酶活力提高了48.46%。可見吐溫-80對里氏木霉RutC-30液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶有較好的促進作用。

響應(yīng)面法（Response surface analysis，RSA）是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計方法結(jié)合的產(chǎn)物[19]，具有減少試驗次數(shù)，縮短試驗周期，回歸方程精度高，并能直觀反映因素間的交互作用等特點；可同時對影響試驗的多因素間的交互作用進行優(yōu)化與評估，精確反饋因素與響應(yīng)值間的關(guān)系，并得到最佳的發(fā)酵條件。RSA是目前微生物發(fā)酵條件優(yōu)化常用的方法。馮培勇等[20]經(jīng)響應(yīng)面條件優(yōu)化酶活力提高了34.4%。本試驗中較未優(yōu)化條件下FPA提高了72.12%。

參考文獻：

[1] HARTLY B S， BRODA P M A， SENIOR P J. Technology in the 1990s： Utilization of lignocellulosic wastes[M]. London： Distributed by Scholium International， 1987.

[2] MTUI G Y S. Recent advance in pretreatment of lignocellulosic wastes and production of value added products[J]. Afr J Biotech， 2009， 8（8）： 1398-1415.

[3] 陸 晨.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2012.

[4] 吳楊林.里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2013.

[5] 潘春梅，王 輝，任 敏.纖維素酶液體發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31（8）：210-214.

[6] 張立霞.纖維降解菌組合的篩選、優(yōu)化及對玉米秸稈的降解效果[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[7] 陳曉萍，孫付保，陳曉旭，等.響應(yīng)面法優(yōu)化康寧木霉產(chǎn)纖維素酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011，30（1）：106-112.

[8] 石 儉.玉米芯發(fā)酵飼料的研制及對兔、鴨飼喂效果的研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[9] 高鳳菊，李春香.真菌與細菌纖維素酶研究進展[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報，2005，27（2）：7-10.

[10] 任紅梅.產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及對玉米芯降解的研究[D].蘭州：蘭州理工大學(xué)，2013.

[11] 霍志梅.利用玉米芯工業(yè)纖維廢渣生產(chǎn)纖維素酶以及燃料乙醇的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2011.

[12] 王 芳，陳介南，張 林，等.產(chǎn)纖維素酶里氏木霉的研究進展[J].中國釀造，2014，33（6）：1-5.

[13] 王強強，莫海飛，董 靜，等.高產(chǎn)纖維素酶菌株的微波誘變及篩選研究[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2014，35（3）：5-7.

[14] 楊麗娜，張 建，龔月生.響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus subtilis NP29產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究[J].飼料工業(yè)，2012，33（14）：48-52.

[15] ZIMBARDI A L R L， SEHN C， MELEIRO L P， et al. Optimization of β-glucosidase， β-xylosidase and xylanase production by Colletotrichum graminicola under solid-state fermentation and application in raw sugarcane trash saccharification[J]. Int J Mol Sci， 2013， 14（2）：2875-2902.

[16] 時進鋼.表面活性劑對堆肥過程中微生物胞外酶的作用及其機理研究[D].長沙：湖南大學(xué)，2007.

[17] 劉 佳，袁興中，曾光明，等.表面活性劑對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶影響的實驗研究[J].中國生物工程雜志，2006，26（8）：62-66.

[18] 王亞林，嚴建芳.表面活性劑對木霉菌產(chǎn)纖維素酶的影響[J].生物技術(shù)，2002，12（3）：37-38.

[19] 王永菲，王成國.響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J].中央民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，14（3）：236-240.

[20] 馮培勇，趙彥宏，張 麗.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：335-339.endprint