羅光明　董艷凱　朱玉野等

摘要： 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對20個產(chǎn)地的梔子種子進行酯酶（EST）、過氧化物酶（POD）同工酶測定和譜帶分析，用Ntsys 2 10軟件計算遺傳相似性系數(shù)，并進行聚類分析，評價不同種源的親緣關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20個產(chǎn)地的梔子種子在2個同工酶系統(tǒng)中均有梔子物種的共同特征譜帶，但酶帶數(shù)量與活性強度有差異，酯酶同工酶共出現(xiàn)9個譜帶類型，Rf值范圍0 64～0 90，其中Rf值0 67、0 71、0 73為3條特征譜帶；過氧化物酶同工酶共出現(xiàn)5個譜帶類型，Rf值范圍0 70～0 77，其中Rf值0 70為特征譜帶；酯酶同工酶和過氧化物酶同工酶圖譜能大致反映不同種源之間的遺傳相似度，不同產(chǎn)地的梔子遺傳相似度在0 50～1 00之間。酯酶同工酶和過氧化物同工酶圖譜帶能有效地鑒定出種子真實性，并能大致區(qū)分梔子種子的來源。

關鍵詞： 梔子；種子；同工酶；真實性；聚類分析

中圖分類號： R282 5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0244-03

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的成熟果實，入心、肝、肺、胃經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效，內(nèi)服用于熱病心煩、黃疽尿赤、血淋澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍，外治扭挫傷痛 [1]。主要含環(huán)烯醚萜類、西紅花苷類、黃酮類等成分，是衛(wèi)生部頒布的第1批藥食兩用資源。梔子還有很多其他用途，梔子是古代應用廣泛的黃色染料，現(xiàn)代還用于提取工業(yè)染料和食用色素。國內(nèi)外對于梔子的需求量很大，且不斷上升，具有很好的市場前景，野生的梔子資源已經(jīng)難以滿足市場需求，只能靠人工栽培來解決這一問題。但梔子種子混雜現(xiàn)象嚴重，不同產(chǎn)地的種子良莠不齊，不利于大面積的栽培繁殖。

同工酶是生物體代謝的調(diào)節(jié)者，與生理功能和細胞分化相聯(lián)系，而且同工酶的發(fā)生與基因進化及種的演變有關。它不僅是生理指標，也是可靠的遺傳指標 [2]。根據(jù)同工酶譜的變化，可以用來鑒別生物類別及其親緣關系 [3]。盡管可用來分析的同工酶有百余種，但過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）是2種最常被用來分析的同工酶 [4]。本研究通過分析梔子種子過氧化物酶、酯酶同工酶譜帶的多樣性來評價種群間的遺傳差異，為種質(zhì)資源的保障提供可靠的參考依據(jù)。同時通過確立梔子種子同工酶特征譜帶，為種子真實性鑒定、藥材品種鑒別和資源的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

樣品為2013年11—12月采自湖南省、江西省、湖北省、浙江省、廣西壯族自治區(qū)、重慶市、四川省等20個地區(qū)野生或栽培居群梔子的種子，具體來源和編號見表1。將已經(jīng)除去外果皮和果肉的種子漂洗干凈，選取健康飽滿的種子放在密封袋里保存。

1 2 方法

1 2 1 酶液制備

取不同產(chǎn)地梔子干種子0 5 g，加入2 mL提取液（1 mol/L Tris-HCl，pH值6 8），冰浴研磨勻漿，12 000 r/min 條件下離心10 min 2次。上清液即為酶提取液，用于同工酶分析。加入等體積的40%蔗糖溶液、0 1%溴酚藍25 μL，-20 ℃冰箱保存、備用，使用時于4 ℃下溶解。

1 2 2 電泳

采用電泳儀（天能EDS300型）和DYCZ-30B型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）進行垂直平板不連續(xù)系統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離同工酶，膠板厚度為 1 5 mm。分離膠緩沖液為1 5 mol/L Tris-HCl，pH值8 9，酯酶同工酶采用10%的分離膠，過氧化物酶采用8%的分離膠；濃縮膠4%，緩沖液為0 5 mol/L Tris-HCl，pH值6 8。電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)（15 14 g的Tris加72 07 g的甘氨酸，用雙蒸水定容至5 L）。在冰浴條件下，濃縮膠穩(wěn)壓 100 V，分離膠穩(wěn)壓200 V，電泳時間1 5～2 0 h，溴酚藍至玻璃板底部0 5 cm時停止電泳。每孔上樣40 μL，重復2次。

1 2 3 染色

（1）酯酶染色。稱取100 mg重氨堅牢藍溶于100 mL磷酸緩沖液（11 876 g Na2HPO4·2H2O定容于 1 000 mL 的容量瓶中，9 078 g KH2PO4定容于1 000 mL的容量瓶中，然后以3 ∶ 7的比例混合即可）。加9 mL 1 3%的乙酸-β-萘酯（用丙酮配制），6 mL 2 5%的β-醋酸萘酯（用83%丙酮配制，現(xiàn)用現(xiàn)配）。室溫下染色30 min，待褐色酶帶顯示清晰后棄掉染色液。用7%冰乙酸固定30 min，用蒸餾水將凝膠沖洗干凈后觀察。（2）過氧化物酶染色。稱取2 g聯(lián)苯胺溶于18 mL冰乙酸，加72 mL雙蒸餾水（ddH2O）配成母液，染色液取5 mL染色母液加入93 mL ddH2O，染色前加 2 mL 3%H2O2。室溫下染色 30 min，顯示出藍色譜帶并轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣髼壍羧旧?，用水將凝膠沖洗干凈后觀察。

1 2 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

染色后照相，作出酶譜圖，記錄酶帶遷移距離，計算遷移率（Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離）。根據(jù)每張同工酶圖譜上的譜帶分布確定帶的有無，并轉(zhuǎn)化成二項數(shù)據(jù)，在同一Rf處，有譜帶的條帶記為1，無譜帶的記為0，把同工酶譜信息處理為0、1數(shù)據(jù)后，通過NTSYS 210軟件，計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2 1 梔子酯酶和過氧化物酶同工酶酶譜分析

對20個不同產(chǎn)地的梔子種子依序進行酯酶和過氧化物酶同工酶測試。參照王中仁的方法 [5]確定9個酯酶同工酶位點，即 EST1～EST9，各位點集中在中（SF，0 33

5個過氧化物酶同工酶位點，即POD1～POD5，集中在快（0 7

2 2 梔子種子真實性鑒別

在酯酶和過氧化物酶同工酶的所有位點中，EST Rf值為0 67、0 71、0 73的條帶，POD Rf值為0 70的條帶活性強，帶深、染色清晰、較穩(wěn)定，染色時出現(xiàn)較快，分辨率高，為主酶帶，可以作為種子酯酶和過氧化物酶同工酶的特征酶帶，依據(jù)此特征帶可以準確地鑒定種子的真實性。

2 3 種子遺傳距離分析

以同工酶圖譜記錄數(shù)據(jù)及相似系數(shù)為測量指標，記錄酶譜間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見表2。從表2可以看出，各個種源間的遺傳相似度在0 50～1 00之間，說明不同種源的梔子種子間有不同程度的遺傳差異，但整體上梔子種子親緣關系比較接近。采用NTSYS軟件對20個不同產(chǎn)地的梔子種子的親緣關系及遺傳差異進行聚類分析，結(jié)果見圖3。從樹狀圖可以看出，20個種質(zhì)資源可以分為5類：1、12、13、14、15、18為一類種質(zhì)資源，2、4、11、16、17為一類種質(zhì)資源，3、5、6、8、9、10為一類種質(zhì)資源，7為一類種質(zhì)資源，19、20為一類種質(zhì)資源。

由圖3還可以看出，某些省份之間種源的差異較明顯：江西省的5個種源被分在3個不同的類群；湖北省的3個種源被分類在2個類群，且類群之間遺傳距離較大；福建省寧德市福鼎市分水關的種質(zhì)資源與其他產(chǎn)地的資源差異最明顯，為單[CM（25]獨的一類；浙江省的種質(zhì)資源差異小，屬于同一類群。此外，江西省吉安市與湖南省永州市、福建省寧德市與四川省資陽市地理位置較遠，氣候條件差異明顯，但4號與17號樣品、6號與10號樣品具有相同的遺傳相似度。在小范圍內(nèi)，6號、7號樣品均產(chǎn)自福建省寧德市，但遺傳差異顯著，遺傳距離很大；11號、12號均產(chǎn)自廣西省南寧市，遺傳相似度為0 79；而1號、2號與12號的遺傳相似度為0 86。由此可見，梔子種子的遺傳關系與地域沒有必然的聯(lián)系，可能由于不同產(chǎn)地之間最初引進的種源不同。

3 討論

同工酶是基因編碼的產(chǎn)物，它在電場中遷移率的改變反映了酶蛋白的大小、構形和肽鏈氨基酸的序列變化，即編碼DNA上的變化，所以可通過分析同工酶酶譜的變化獲得我們所需要的遺傳信息 [7]。植物同工酶分析技術為估計植物群體遺傳多型性、分析種內(nèi)及種間差異、探討植物起源與進化等提供了可靠的試驗手段 [8]。利用過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶來研究種間的親緣關系已經(jīng)很遍，種子真實性和品種純度代表種子的遺傳品質(zhì)。在本研究范圍內(nèi)，不同產(chǎn)地種子之間的酶帶有共同的分布圖譜，也有各自的酶譜特征，說明它們之間存在基因組的差異。

同一居群中一定種類的同工酶譜帶相對穩(wěn)定，所以選擇一定種類的同工酶是鑒定藥用植物及其原產(chǎn)地的適宜生化指標 [9]。本試驗表明，EST、POD同工酶是梔子種子純度鑒定宜選的酶系統(tǒng)，鑒定不同種源之間的遺傳相似度宜選用酯酶同工酶圖譜。梔子是我國大宗藥材，栽培歷史悠久，在引種栽培過程中，受多年的自然環(huán)境變化及不同產(chǎn)地之間地理、氣候等諸多不同因素的影響，其遺傳多樣性是否遭到破壞尚不十分清楚。本研究通過對全國范圍內(nèi)具有代表性的20個不同產(chǎn)地梔子種子的酯酶與過氧化物酶同工酶酶譜進行分析，探究不同產(chǎn)地種源之間的遺傳多樣性，結(jié)果表明，不同種源之間的同工酶圖譜既有梔子屬的共同特征譜帶，又具有各自的特征帶，說明不同產(chǎn)地的梔子種源既具有一定的遺傳穩(wěn)定性，又存在各自的遺傳特征。通過對梔子的過氧化物酶、酯酶同工酶酶譜分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)、不同栽培類型梔子的酶譜均存在一定差異，這也為揭示它們之間藥性、藥效、有效成分含量存在差異的原因提供一定的研究基礎 。

目前梔子通過種子繁育技術大力發(fā)展人工種植栽培，而穩(wěn)定的種源將是保證種子質(zhì)量的前提與關鍵 [10]。本研究通過梔子種子酯酶同工酶和過氧化物酶同工酶來探討梔子種質(zhì)遺傳關系，本方法具有簡便易操作、周期短、成本低等優(yōu)勢。種源間的親緣關系可根據(jù)酶譜特征有效地反映出，便于鑒別種源，有利于篩選優(yōu)良品種，提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量 [11]。

[HS2 2][HT8 5H]參考文獻： [HJ1 8mm]

[1] 傅春升，婁紅祥，張學順 梔子的化學成分與藥理作用[J] 國外醫(yī)藥：植物藥分冊，2004，19（4）：152-156

[2]周延清，楊清香，張改娜 生物遺傳標記與應用[M] 北京：化學工業(yè)出版社，2008

[3]陳紅林，陳志遠，梁作侑，等 泡桐屬植物同工酶分析[J] 湖北林業(yè)科技，2003（2）：1-4

[4]鄒春靜，盛曉峰，韓文卿，等 同工酶分析技術及其在植物研究中的應用[J] 生態(tài)學雜志，2003，22（6）：63-69

[5]王中仁 植物等位酶分析[M] 北京：科學出版社，1996：10-36

[6]易剛強，李云耀，崔培梧，等 梔子過氧化物酶、酯酶同工酶的遺傳多樣性分析[J] 中南藥學，2012，10（6）：428-432

[7]季維智，宿 兵 遺傳多樣性研究的原理與方法[M] 杭州：浙江科學技術出版社，1999：71

[8]伍世平，王君健，于志熙 10種草坪及地被植物的同工酶研究[J] 武漢植物學研究，1994，12（3）：259-262

[9]張袖麗，謝中穩(wěn)，陶漢之 半夏屬植物同工酶的電泳分析[J] 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1997，24（3）：291-295

[10] 方 磊，羅光明，蔡財軍 等 草珊瑚種子遺傳多樣性的酯酶同工酶研究[J] 江西中醫(yī)學院學報，2011，23（3）：42-44

[11]韓琳娜，李紅梅 白花丹參和紫花丹參生化標記分析[J] 時珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：211-212