魏紅 王敬萍 柴曉紅 王日軍 楊晉靜 龐工力 王寧 王婧

辛伐他汀聯(lián)合依折麥布對(duì)急性心肌梗死患者T淋巴細(xì)胞亞群比例影響的研究

魏紅 王敬萍 柴曉紅 王日軍 楊晉靜 龐工力 王寧 王婧

作者單位：030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

目的 比較辛伐他汀聯(lián)合依折麥布和單用辛伐他汀治療對(duì)急性心肌梗死（AMI）患者外周血CD4+CD28-調(diào)節(jié)T細(xì)胞和CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例的影響，探討依折麥布聯(lián)合辛伐他汀在AMI治療中的作用。方法 選擇2014年4～11月在山西省心血管病醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室住院并治療的AMI患者40例，隨機(jī)分為對(duì)照組及試驗(yàn)組。對(duì)照組（20例）給予辛伐他汀40 mg每晚1次；試驗(yàn)組（20例）給予辛伐他汀40 mg每晚1次，聯(lián)合依折麥布10 mg每日1次。所有患者分別于治療前及治療后15 d通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+CD28-T細(xì)胞及CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例。結(jié)果 對(duì)照組治療前CD4+CD28-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（95.41±5.24）%，與治療15 d后的（95.07±2.24）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組治療前CD4+CD28-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（93.55±6.43）%，較治療15 d后的（91.72±4.98）%下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組治療前CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（0.81±0.79）%，與治療15 d的（0.86±0.86）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組治療前CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（0.85±0.87）%，與治療15 d后的（0.62±0.57）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論 AMI患者應(yīng)用辛伐他汀聯(lián)合依折麥布治療可下調(diào)外周血CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞，而對(duì)CD4+CD25+FoxP3+T淋巴細(xì)胞無(wú)明顯影響。

急性心肌梗死； 動(dòng)脈粥樣硬化； CD4+CD28-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 流式細(xì)胞術(shù)

cell； CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cell； Flow cytometry

急性心肌梗死（AMI）的主要病理基礎(chǔ)為不穩(wěn)定的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊破裂、出血及繼發(fā)性血栓形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔完全或不完全堵塞。AS是慢性炎癥性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，AS損傷處聚集的T淋巴細(xì)胞主要是CD4+CD28-T細(xì)胞[1]，該細(xì)胞亞群具有高效的促炎特征，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群可通過(guò)直接細(xì)胞接觸抑制或分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子白介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）抑制炎癥反應(yīng)[2]。依折麥布是一種選擇性的小腸膽固醇吸收抑制劑，且和他汀類藥物一樣具有多效應(yīng)，如抗炎[3]、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制炎癥因子和單核細(xì)胞遷移等作用。本研究比較辛伐他汀聯(lián)合依折麥布和單用辛伐他汀治療，對(duì)AMI患者外周血CD4+CD28-調(diào)節(jié)T細(xì)胞和CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年4～11月在山西省心血管病醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室住院確診的AMI患者40例，其中男性27例、女性13例，年齡35～75（57.2± 14.8）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：AMI診斷按照世界衛(wèi)生組織冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，有典型的缺血性胸痛癥狀持續(xù)時(shí)間≥30 min，胸痛發(fā)作時(shí)伴隨心肌缺血的心電圖改變，且有心肌損傷標(biāo)志物（心肌酶及肌鈣蛋白I升高）。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性病毒性肝炎，脂肪肝，肝功能異常（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶大于1.5倍正常上限），腎功能異常（血肌酐大于2.0 mg/dl），甲狀腺疾病，心功能級(jí)Ⅲ或Ⅳ級(jí)，自身免疫性疾病，腫瘤及正在接受免疫調(diào)節(jié)劑及他汀治療等。將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者隨機(jī)分為對(duì)照組（20例）和試驗(yàn)組（20例）。對(duì)照組給予辛伐他汀40 mg，每晚1次，口服；試驗(yàn)組給予辛伐他汀40 mg，每晚1次，聯(lián)合依折麥布10 mg，每日1次，口服。以上治療均經(jīng)患者同意。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器 熒光素耦聯(lián)抗體（美國(guó)BD公司產(chǎn)品）PE-抗CD28，APC-抗CD25，PE-抗Foxp3，F(xiàn)ITC-抗CD4；流式細(xì)胞儀FACSCalibur（美國(guó)Becton Dickinson公司）；人外周血淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限責(zé)任公司）

1.2.2 資料收集 全部受試者于入院第2天和第15天清晨空腹、平臥狀態(tài)下采集肘靜脈血2 ml，用EDTA抗凝，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+CD28-調(diào)節(jié)T細(xì)胞和CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞。

1.2.3 試驗(yàn)方法 依據(jù)密度梯度離心法原理，將淋巴細(xì)胞分離液2 ml加入試管中，并將2 ml抗凝全血與PBS液1∶1進(jìn)行混勻后緩慢加入到分離液上，用1500 r/min離心15 min，收集第2層淋巴細(xì)胞，用PBS液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/ml后，分別檢測(cè)CD4+CD28-調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞及 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

1.2.3.1 CD4+CD28-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè) 檢測(cè)管加入FITC-抗CD4標(biāo)記的抗人 CD4 20μl，PE標(biāo)記的抗人CD28 20μl，檢測(cè)管加入100μl Buffer液避光孵育20 min。洗滌細(xì)胞后，用250μl緩沖液重懸細(xì)胞后立即上機(jī)分析。

1.2.3.2 CD4+CD25+Foxp+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè) 檢測(cè)管加入FITC-抗CD4標(biāo)記的抗人CD4 20μl，APC標(biāo)記的抗人CD25 20μl，于檢測(cè)管加入100μl Buffer液避光孵育20 min。洗滌細(xì)胞后固定細(xì)胞，加入2ml人Foxp3 Buffer A，混勻后避光孵育10min。于細(xì)胞破膜后加入0.5 ml人Foxp3 Buffer C工作液，混勻后避光孵育30 min。洗滌細(xì)胞后于檢測(cè)管加入PE標(biāo)記的抗人Foxp3 20μl，避光孵育30min。洗滌細(xì)胞后，用250μl緩沖液重懸細(xì)胞后立即上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 對(duì)照組及試驗(yàn)組比較，年齡、性別、吸煙，合并高血壓、糖尿病比例，血液生化檢測(cè)等基線資料比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床基線資料比較（±s）

表1 兩組臨床基線資料比較（±s）

注：TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

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2.2 兩組治療前、后血脂比較 對(duì)照組治療15 d后TC及LDL-C均較治療前下降（P＜0.05）；試驗(yàn)組治療后總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇明顯下降（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 治療后兩組血脂比較（±s）

表2 治療后兩組血脂比較（±s）

注：TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

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2.3 兩組治療前、后CD4+CD28-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比比較 對(duì)照組治療后15 d，CD4+CD28-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（95.07±2.24）%，與治療前的（95.41±5.24）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；試驗(yàn)組治療后15 d，CD4+CD28-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（91.72±4.98）%，較治療前的（93.55±6.43）%下降（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

2.4 兩組治療前、后CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比比較 對(duì)照組治療后15 d，CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比為（0.86± 0.86）%，與治療前的（0.81±0.79）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；試驗(yàn)組治療后15 d，CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞占 CD4+T細(xì)胞百分比為（0.85± 0.87）%，與治療前的（0.81±0.79）%比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

表3 兩組患者治療前后CD4+CD28-T細(xì)胞比例（±s）

表3 兩組患者治療前后CD4+CD28-T細(xì)胞比例（±s）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)試驗(yàn)組治療前后CD4+CD28-T細(xì)胞的比例

表4 兩組患者治療前后CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞比例（±s）

表4 兩組患者治療前后CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞比例（±s）

組別治療前CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞（占CD4+T細(xì)胞%）治療后CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞（占CD4+T細(xì)胞%）P值對(duì)照組 0.81±0.79 0.86±0.86 0.34試驗(yàn)組 0.62±0.57 0.85±0.87 0.20

3 討論

AMI是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，急性期死亡率高，其中血膽固醇水平升高是冠心病死亡的主要危險(xiǎn)因素。目前對(duì)于AMI患者，無(wú)論其LDL-C濃度基線如何，都應(yīng)給予他汀類藥物調(diào)脂治療。辛伐他汀不但可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制羥甲戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）活性，同時(shí)在有效降低LDLC同時(shí)可以減少冠心病事件的發(fā)生[4]，減少患者的死亡率及心血管事件，他汀類藥物還具有多效性包括抗炎、抗氧化、抗增殖和抗血小板等作用[5]。依折麥布是NPC1L1抑制劑。NPC1L1是位于空腸和回腸近端刷狀緣的腸上皮細(xì)胞，是膽固醇主要吸收部位。在NPC1L1缺陷小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其腸道對(duì)膽固醇的吸收減少70%[6]。有研究報(bào)道，依折麥布本身并不能明顯改善動(dòng)脈粥樣硬化或血管事件，而他汀類藥物與依折麥布聯(lián)合應(yīng)用比單藥治療對(duì)膽固醇的抑制作用更為有效[7]。此外，依折麥布和他汀類一樣，具有抑制炎癥因子和單核細(xì)胞遷移等作用。Liuzzo等[1]發(fā)現(xiàn)，AS損傷處聚集的T淋巴細(xì)胞主要是CD4+CD28-T細(xì)胞，該細(xì)胞亞群具有高效的促炎特征,可產(chǎn)生高水平γ干擾素（INF-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α），并激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而引起下游炎癥反應(yīng)，可溶解內(nèi)皮細(xì)胞和損傷平滑肌細(xì)胞，且與急性冠脈事件的再發(fā)生有相關(guān)性[8]。CD4+CD25+Foxp3+主要為天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg）并且與自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、感染及腫瘤免疫等相關(guān)。Mor等[9]發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性冠脈綜合征的患者中是減少的。CD4+CD25+Foxp3+Treg可以通過(guò)細(xì)胞直接接觸抑制靶細(xì)胞的活化、增殖及分化，并且可以通過(guò)分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子影響T細(xì)胞活化，以及通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)空間來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化等機(jī)制發(fā)揮其免疫抑制功能。其抗AS作用可能與分泌抑制性細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β）或直接細(xì)胞間接觸從而抑制初始T細(xì)胞的增殖來(lái)發(fā)揮其抗AS的作用[10]。所以，CD4+CD25+Foxp3+Treg可能對(duì)AMI患者斑塊的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)對(duì)AMI患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀聯(lián)合依折麥布治療15 d，CD4+CD28-T占CD4+T細(xì)胞百分比下降（P＜0.05），而單用辛伐他汀無(wú)變化，提示對(duì)于AMI患者辛伐他汀聯(lián)合依折麥布治療具有協(xié)同抗炎作用。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)試驗(yàn)組治療前后CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞的比例

在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中炎癥及免疫因子廣泛參與并發(fā)揮重要作用。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能在AMI的進(jìn)程中起作用。辛伐他汀聯(lián)合依折麥布能夠使AMI患者CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞亞群降低，可能較單用辛伐他汀有額外獲益。但本研究樣本量較小，需加大樣本量進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。

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Study on effects of Simvastatin combined with Ezetim ibe on proportions of Tlymphocyte subpopulations in patientw ith acutemyocardial infarction

Study on effects of Sim vastatin combined with Ezetim ibe on proportions of Tlym phocyte subpopulations in patient with acutemyocardial infarction

WEIHong，WANG Jing-ping，CHAIXiao-hong，etal.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

WANG Jing-ping，E-mail：1787064049@qq.com

ObjectiveTo compare the effects of Simvastatin combined with Ezetimibe and Simvastatin alone on proportions of peripheral blood CD4+CD28-and CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells in patients with acute myocardial infarction（AMI）and explore the effects of Simvastatin combined with Ezetimibe in AMI.Methods40 AMI patients that were hospitalized and treated in the intensive care unit of Shanxi Cardiovascular Hospital from April 2014 to November 2014 were selected and divided randomly into two groups：the control group and the experimental group，patients in the control group（n=20）were given 40 mg Simvastatin once a day in the evening，while patients in the experimental group（n=20）were given 40 mg Simvastatin once a day in the evening and 10 mg Ezetimibe once a day.For all patients，proportions of peripheral blood CD4+CD28-and CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells were detected by flow cytometry before treatment and 15 days after treatment，respectively.ResultsThere was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD28-T cells in CD4+T cells before treatment（95.41±5.24）%and 15 days after treatment（95.07±2.24）%in the control group，while for the experimental group，the percentage of CD4+CD28-T cells in CD4+T cells 15 days after treatment（91.72±4.98）%decreased compared to that before treatment（93.55±6.43)%，with statistical significance（P＜0.05），there was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells before treatment（0.81±0.79）%and 15 days after treatment（0.86±0.86）%in the control group，and for the experimental group，there was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells before treatment（0.85±0.87）%and 15 days after treatment（0.62±0.57）%.Conclusion Application of Simvastatin combined with Ezetimibe in AMI patients can down-regulate peripheral blood CD4+CD28-T lymphocytes but has no significant impact on CD4+CD25+FoxP3+T lymphocytes.

Acute myocardial infarction； Coronary atherosclerotic； CD4+CD28-regulatory T

王敬萍，E-mail:1787064049@qq.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.05.011

R542.2+2

A

1672-5301（2015）05-0425－04