鄭明華+范學(xué)政

[摘要] 目的 探討側(cè)腦室注射醒腦靜對腦出血（ICH）大鼠血腫周圍TLR4及炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響。 方法 采用大鼠尾狀核自體血注射法制作大鼠ICH模型，隨機(jī)分成模型組、側(cè)腦室組、靜脈組，并設(shè)立正常組。對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，采用HE染色觀察炎性浸潤情況，通過免疫組化檢測TLR4、TNF-α和IL-1β的表達(dá)。 結(jié)果 側(cè)腦室組第24、48、72小時的神經(jīng)功能評分顯著低于靜脈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)腦室組的炎性細(xì)胞浸潤較靜脈組輕。模型組的TLR4、IL-1β和TNF-α平均積分光密度值顯著高于靜脈組和側(cè)腦室組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)腦室組的TLR4和TNF-α平均積分光密度值顯著低于靜脈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 側(cè)腦室注射醒腦靜能顯著抑制ICH血腫周圍的炎性細(xì)胞浸潤及TLR4、TNF-α表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 醒腦靜；腦出血；側(cè)腦室注射；TLR4；IL-1β；TNF-α

[中圖分類號] R743.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）07（b）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the influence of intracerebroventricular injection of Xingnaojing on expression of TLR4 and inflammatory factor such as TNF-α，IL-1β in the cerebral hemorrhage （ICH）. Methods The model of ICH was maked by injected autoblood from tail artery into right caudate nucleus in rats，and which were randomly divided into the model group，the lateral ventricle group，the venous group and the normal group.Behavior scores of rats in each group was observed.Inflammatory infiltration was observed through HE stain.Immunohistochemistry was used to detect the expression of TLR4，TNF-α and IL-1β. Results The score of the neurological function in the lateral ventricle group at the 24th，48th，72th hours was lower than that in vein group，with significant difference（P<0.05）.The infiltration of inflammatory cells in the lateral ventricle group was lower than that in the venous group.The average integral optical density of TLR4，IL-1β and TNF-α in the model group was higher than that in the venous group and the lateral ventricle group，with significant difference（P<0.05）.The average integral optical density of TLR4 and TNF-α in the lateral ventricle group was lower than that that in the venous group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Intracerebroventricular injection of Xingnaojing can significantly inhibit the infiltration of inflammatory cells and expression of TLR4，TNF-α of ICH around the hematoma.

[Key words] Xingnaojing；Intracerebral hemorrhage；Intracerebroventricular injection；Toll-like receptor-4；Interleukin-1β；Tumor necrosis factor-α

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神經(jīng)科的常見病和多發(fā)病，病情來勢急驟，病死率及致殘率均高。ICH的病理損傷除血腫占位性效應(yīng)及對周圍腦組織的破壞作用外，炎性因子介導(dǎo)的炎癥在繼發(fā)性腦損傷中也起著重要作用[1]。Toll樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）是TLRs家族中的重要成員之一，能夠激活核因子（nuclear factor kappa B，NF-κB），導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑布式釋放，最終產(chǎn)生損傷效應(yīng)[2]。目前的研究顯示，醒腦靜注射液具有抗炎、抗凋亡、改善神經(jīng)功能等作用[3]，但其相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，尤其是關(guān)于醒腦靜在ICH中對TLR4信號通路及IL-1β和TNF-α炎性因子表達(dá)的影響研究較少。已有研究顯示，在對ICH乃至顱腦損傷和其他出血性腦血管疾病患者進(jìn)行外科手術(shù)時，腦室、血腫腔或蛛網(wǎng)膜下腔等局部藥物沖洗或灌注能夠明顯改善神經(jīng)功能癥狀[4-5]，但缺乏關(guān)于側(cè)腦室注射醒腦靜能否促進(jìn)ICH神經(jīng)功能恢復(fù)的相關(guān)研究。為進(jìn)一步開發(fā)和闡明醒腦靜治療ICH的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠尾狀核自體血注射法制作大鼠ICH模型，應(yīng)用神經(jīng)功能評分、HE染色和免疫組化比較醒腦靜側(cè)腦室給藥途徑與靜脈注射給藥中的ICH血腫周圍組織炎性細(xì)胞浸潤和TLR4、IL-1β、TNF-α表達(dá)，旨在探討醒腦靜更有效的給藥途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 體重為280～300 g清潔級健康雄性SD大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）2014-0002。實(shí)驗(yàn)期間動物自由飲用自來水并進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，術(shù)前8 h禁食水。將SD大鼠隨機(jī)分成模型組、側(cè)腦室組、靜脈組和正常組，每組10只。

1.1.2 主要試劑 醒腦靜注射液由無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司提供，兔抗TLR4多克隆一抗、兔抗TNF-α多克隆一抗、兔抗IL-1β多克隆一抗由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供，SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色盒由北京中杉金橋有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制備模型 采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，將其固定于立體定向儀上，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定右側(cè)尾殼核位置；在頭皮正中切開約0.8 cm的切口，剪開骨膜，暴露前囟，于前囟前0.2 mm、中線右旁開3 mm處鉆一直徑為l mm的孔；用微量注射器經(jīng)尾動脈采血50 μl后，固定于立體定向儀上沿針孔垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度為6.0 mm（此為尾殼核的位置），注射時間2 min，留針10 min，緩慢退針。

1.2.2 藥物干預(yù) 側(cè)腦室組在大鼠腦缺血模型制備后，將其固定于定位儀上，切開皮膚，暴露顱骨，以前囟正中線后端為零點(diǎn)，選取向后1.0 mm、向左1.5 mm處為進(jìn)針點(diǎn)，穿刺針進(jìn)針4 mm，微量注射器左側(cè)側(cè)腦室注射10 μl/kg醒腦靜注射液。靜脈組在大鼠腦缺血模型制備后從大鼠尾靜脈注射20 μl/kg的醒腦靜。模型組、正常組均從大鼠尾靜脈注射20 μl/kg的生理鹽水。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 動物蘇醒后為第0 h，分別于第0、12、24、48、72 h采用Bederson法[6]對各組大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分，具體內(nèi)容如下。0分：未出現(xiàn)任何神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時病灶對側(cè)的肢體屈曲內(nèi)收；2分：一側(cè)側(cè)推抵抗力下降，同時伴有提尾時病灶對側(cè)的肢體屈曲內(nèi)收；3分：自由活動時向癱瘓側(cè)劃圈并伴有一側(cè)側(cè)推抵抗力下降；4分：意識喪失。

1.2.4 解剖、HE染色 于第72 h麻醉大鼠，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水、4%多聚甲醛，切取以針孔為中心的腦組織，完整保留出血灶及其周圍，浸泡于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，逐級乙醇脫水、石蠟包埋、切片，再HE染色，觀察血腫周圍的炎性侵潤情況。

1.2.5 免疫組化免疫組化 取上述包埋好的石蠟，4 μm連續(xù)切片作TLR4、IL-1β、TNF-α細(xì)胞免疫組化染色，按免疫組化SP法試劑盒說明書操作，陰性對照用PBS代替一抗。在光鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。每只大鼠的腦組織各取3張切片，每張切片選取互不重復(fù)的5個視野（×200倍），采用Image-proplus 6.0軟件測定每個視野的積分光密度值（IOD）和陽性面積（area），計(jì)算平均積分光密度（IOD/area）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中方差齊時采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊時采用Games-Howell檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間神經(jīng)功能缺損評分的比較

造模后對各組不同時間段的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分，正常組無神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組、靜脈組和側(cè)腦室組則出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，其中模型組在第48小時的評分最高，靜脈組和側(cè)腦室組在第24小時的評分最高。側(cè)腦室組第24、48、72小時的評分顯著低于模型組相同時間段的評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)腦室組第72小時的評分顯著低于靜脈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。靜脈組第48、72小時的評分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 各組HE染色結(jié)果的比較

各組的HE病理染色顯示，模型組、靜脈組和側(cè)腦室組血腫周圍均有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤及組織缺損，正常組無異常表現(xiàn)，模型組炎性侵潤最重，側(cè)腦室組炎性細(xì)胞浸潤較靜脈組輕（圖1）。

2.3 各組TLR4、TNF-α和IL-1β平均積分光密度值表達(dá)的比較

模型組、靜脈組和側(cè)腦室組的TLR4、IL-1β和TNF-α平均積分光密度值顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。靜脈組和側(cè)腦室組的TLR4、IL-1β和TNF-α平均積分光密度值顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)腦室組的TLR4和TNF-α平均積分光密度值均顯著低于靜脈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2，圖2）。

3 討論

血-腦脊液屏障對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義[7]，但在腦損傷時，其也限制了藥物的使用。目前的研究顯示，在腦血管疾病錐顱血腫腔引流的同時給予側(cè)腦室用藥能明顯改善神經(jīng)功能癥狀[5]。臨床研究顯示，中藥復(fù)方制劑醒腦靜注射液對ICH具有良好的治療作用[8]。藥理學(xué)研究顯示，該藥具有除腦水腫、降低顱內(nèi)壓、改善大腦血氧供應(yīng)、調(diào)節(jié)能量代謝、清除自由基反應(yīng)及促進(jìn)腦細(xì)胞康復(fù)等作用[9]，但是關(guān)于其側(cè)腦室給藥能否改善ICH神經(jīng)功能缺損癥狀的研究相對缺乏。

大量的實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察顯示，ICH發(fā)病后各種繼發(fā)因素所致的腦水腫、出血灶周圍炎癥損害是導(dǎo)致腦組織損傷的主要病理機(jī)制[10]。通過干預(yù)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，能夠在很大程度上促進(jìn)ICH患者的病情康復(fù)，改善其預(yù)后[11]。本研究采用側(cè)腦室注射醒腦靜，觀測其對ICH的保護(hù)作用。HE染色顯示，側(cè)腦室組血腫周圍的炎性侵潤較靜脈組明顯減少；神經(jīng)功能缺損評分顯示，通過側(cè)腦室注射醒腦靜能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，提示醒腦靜能有效抑制急性ICH所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，而側(cè)腦室注射醒腦靜能更有效地促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，醒腦靜干預(yù)能夠明顯減少TLR4的表達(dá)。此外，與靜脈給藥相比，側(cè)腦室給藥能夠更有效地減少TLR4的表達(dá)。在炎性調(diào)控過程中，TLR4是胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的上游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[12]，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等重要的病理生理過程[13]。大量實(shí)驗(yàn)研究顯示，TLR4信號途徑主要集中激活NF-κB，進(jìn)而啟動和放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑布式釋放，最終產(chǎn)生損傷效應(yīng)[14]。

ICH血腫周圍的TNF-α和IL-1β是引起炎癥反應(yīng)的主要因子[15]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，側(cè)腦室組血腫的TNF-α和IL-1β陽性細(xì)胞浸潤較靜脈組少，提示醒腦靜側(cè)腦室用藥能夠明顯抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)。研究顯示，TNF-α是ICH血腫周圍大量表達(dá)的多效促炎因子，其在觸發(fā)炎癥反應(yīng)及神經(jīng)損傷中處于中心地位[16]，具有明顯的神經(jīng)毒性和加速細(xì)胞死亡作用[17]，能使血腫周圍的炎癥反應(yīng)不斷加劇，同時也能夠破壞血-腦脊液屏障的完整性，使其通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫和腦細(xì)胞損害[18]。在ICH病理過程中，IL-1β能夠激活血液中的白細(xì)胞[19]，使其經(jīng)過一系列復(fù)雜的機(jī)制穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞游離至出血灶內(nèi)及其周圍，通過釋放血栓烷素和內(nèi)皮素等有毒物質(zhì)加重血腫周圍的繼發(fā)性損害[20]。本研究結(jié)果顯示，在大鼠ICH高峰期，醒腦靜側(cè)腦室用藥能夠明顯減少TLR4、IL-1β、TNF-α炎性因子的表達(dá)，從而改善ICH后大鼠的神經(jīng)功能，而IL-1β、TNF-α是TLR4下游調(diào)節(jié)因子[8]，由此推斷醒腦靜能通過調(diào)節(jié)TLR4炎性調(diào)節(jié)通路介導(dǎo)抑制ICH后的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，醒腦靜能夠抑制炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)ICH神經(jīng)功能康復(fù)，而醒腦靜側(cè)腦室用藥更能夠明顯地抑制CNS炎性浸潤和血腫周圍嚴(yán)重的炎性損傷，提示醒腦靜側(cè)腦室用藥是促進(jìn)ICH神經(jīng)功能康復(fù)的有效用藥途徑，可能成為治療ICH的新方法。由于ICH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜及炎癥反應(yīng)的連鎖效應(yīng)，因此今后還需深入研究醒腦靜側(cè)腦室用藥對CNS炎癥反應(yīng)的影響，以便為臨床治療ICH提供更有效的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2015-05-08 本文編輯：祁海文）