扶昭富+李攻科??胡玉斐

摘 要 基于氫化可的松對(duì)Ag配合物-H2SO4體系化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增敏作用，建立了一種測(cè)定血清中氫化可的松的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析方法。當(dāng)H2SO4濃度為1.0 mol/L，Ag配合物濃度為2.5×10

4 mol/L，流速為4.20 mL/min時(shí)，體系具有最強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與氫化可的松濃度在3.0×10

～1.0×10

7 g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為2.2×10

10 g/mL （3σ）。對(duì)5.0×10

8 g/mL氫化可的松連續(xù)平行測(cè)定11次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%。本方法成功地用于人血清中氫化可的松的含量測(cè)定，回收率為93.0%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～3.2%之間。通過研究該體系的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，探討了可能的化學(xué)發(fā)光機(jī)理。

關(guān)鍵詞 化學(xué)發(fā)光； 流動(dòng)注射； 氫化可的松； Ag配合物； 血清

[HT][HK][FQ（32，X，DY-W][CD15] 2015-07-21收稿； 2015-08-06接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos.21475153， 21107008， 91232703）及高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目（No.20120171110001）

* E-mail： cesgkl@mail.sysu.edu.cn； huyufei@mail.sysu.edu.cn[HT]

1 引 言

氫化可的松（Hydrocortisone，分子結(jié)構(gòu)見圖1）是人腎上腺產(chǎn)生的一種腎上腺糖皮質(zhì)激素，它在人體生理過程中起著至關(guān)重要的作用。氫化可的松主要作用包括參與免疫和代謝兩方面。在免疫方面，氫化可的松主要起抗炎和免疫抑制作用，影響體內(nèi)免疫球蛋白的生成[1]； 在代謝行為方面，它主要是參與中間代謝（通常是分解代謝），例如減少體內(nèi)組織對(duì)葡萄糖的吸收，通過加速葡萄糖異生酶在肝臟的合成加強(qiáng)葡萄糖異生作用[2]。血液中氫化可的松的濃度通?？梢苑从硻C(jī)體應(yīng)激性亢進(jìn)水平[3]。氫化可的松在臨床上可用于診斷與其濃度水平相關(guān)的疾病，如阿狄森病患者的腎上腺類固醇排泄水平低，庫欣綜合征患者體內(nèi)氫化可的松生產(chǎn)過剩。此外，高血清水平（氫化可的松）也發(fā)現(xiàn)存在于應(yīng)激反應(yīng)，如精神疾病、肥胖、糖尿病、酗酒和懷孕人群。低水平的皮質(zhì)醇見諸于腎上腺酶缺陷患者和長(zhǎng)時(shí)間處于壓力下的人群[4]。

已報(bào)道的測(cè)定氫化可的松的方法包括免疫法[5，6]、液相色譜法[7，8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10～12]、毛細(xì)管電色譜[13]等。然而，這些方法都存在一定的缺陷，例如色譜法和質(zhì)譜法需要昂貴的儀器，對(duì)環(huán)境的要求高； 免疫法易受樣品中相似結(jié)構(gòu)的化合物的交叉反應(yīng)影響。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好的氫化可的松檢測(cè)方法具有重要意義?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)具有線性范圍寬、靈敏度高、檢測(cè)限低、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)（FI），化學(xué)發(fā)光法具有重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域[14～18]。超常氧化態(tài)配合物通?？梢栽趬A性環(huán)境中通過多齒配體的絡(luò)合作用而穩(wěn)定存在[19～21]。

[Ag（HIO6）2]5

（Diperiodatoargentate，Ag配合物，簡(jiǎn)寫為DPA）是一種超常氧化態(tài)配合物，也是一種強(qiáng)氧化劑，目前廣泛應(yīng)用于無機(jī)，有機(jī)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及反應(yīng)機(jī)理研究[21]。由于具有強(qiáng)氧化性與良好的催化性能，DPA也逐漸引起分析研究者的關(guān)注?；贒PA和魯米諾的化學(xué)發(fā)光法測(cè)定氫化可的松已有報(bào)道[23]，而發(fā)光試劑如魯米諾等的使用會(huì)影響方法的選擇性。

研究發(fā)現(xiàn)，氫化可的松可大大增強(qiáng)DPA在H2SO4介質(zhì)中產(chǎn)生的微弱化學(xué)發(fā)光信號(hào)，該體系不需要發(fā)光試劑，方法的選擇性也較高。本研究基于該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立了一種靈敏的氫化可的松的分析方法，并成功應(yīng)用于人血清中氫化可的松的檢測(cè)。通過熒光光譜和紫外光譜的研究，探討了可能的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

如圖2所示，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光（FI-CL）系統(tǒng)由兩個(gè)蠕動(dòng)泵用于輸送試液，樣品注射通過一個(gè)帶定量環(huán)的六通閥實(shí)現(xiàn)。系統(tǒng)各部分的連接使用聚四氟乙烯管（直徑0.8 mm）。CL信號(hào)通過BPCL微弱發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)量（中國科學(xué)院生物物理研究所）； LS-45發(fā)光光譜儀 （美國Perkin Elmer 公司）。紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

氫化可的松來源于德國Dr Ehrenstorfe公司，AgNO3，KIO4，K2S2O8和KOH購于上海第一化學(xué)試劑廠。所有試劑都為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。氫化可的松儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氫化可的松100 mg，用甲醇溶解，并定容至100 mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 DPA的合成 按文獻(xiàn)[24]方法，將AgNO3 （1.36 g）， KIO4 （3.24 g）， K2S2O8 （3.00 g），KOH （8.00 g）與200.0 mL去離子水混合，加熱回流40 min，冷卻后過濾，得到DPA，低溫避光保存。通過其在λ=361 nm處的紫外吸光度計(jì)算其濃度（A=εcL， 摩爾吸光系數(shù)ε=1.26×104 L/（mol·cm）。

2.2.2 樣品處理 血清樣品由中山大學(xué)醫(yī)院提供。取適量血清，置于超濾管中，4000 r/min離心20 min，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取3次，收集有機(jī)相并將其蒸干，加入適量水溶解，待測(cè)。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 如圖2所示，在

950 V的負(fù)高壓下，時(shí)間間隔為0.1 s。以水為載流，經(jīng)管道輸入流通池與DPA溶液在流通池中混合，開啟分析系統(tǒng)，待基線平穩(wěn)后，切換閥，通過載流注入100 μL氫

圖2 FI-CL系統(tǒng)裝置圖

Fig.2 Schematic diagram of FI-CL system

P：蠕動(dòng)泵（Peristaltic）； V：進(jìn)樣閥（Valve）； F：流通池（Flow Cell）； PMT：光電倍增管（Photomultiplier Tube）； AMP： 信號(hào)放大器（Amplifier）； HV： 高壓（High Voltage）； REC： 記錄儀（Recorder）； W：廢液（Waste）； HV：

50 V。a： H2SO4； b： Hydrocortisone； c： Water； d： Diperiodatoargentate （DPA）.化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液與H2SO4的混合液，與DPA溶液在流通池中混合，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過檢測(cè)系統(tǒng)記錄反應(yīng)的發(fā)光信號(hào)，在線性范圍內(nèi)，根據(jù)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI（ΔI=I-I0）進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

采用靜態(tài)注射法研究了氫化可的松-DPA-H2SO4體系的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線。用0.1 mL微量注射器將DPA溶液迅速注入到H2SO4和樣品（或水）（1∶1， V/V）的混合液中，產(chǎn)生顯著的化學(xué)發(fā)光。由圖3可見，這是一個(gè)快速反應(yīng)過程，從試劑混合到發(fā)光強(qiáng)度達(dá)最大峰值所用時(shí)間僅為0.5 s，并在5 s內(nèi)完成整個(gè)過程。因此，基于氫化可的松對(duì)DPA-H2SO4發(fā)光反應(yīng)的增敏作用，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)可對(duì)氫化可的松進(jìn)行測(cè)定。

3.2 條件優(yōu)化

3.2.1 進(jìn)樣體積及流速的選擇 進(jìn)樣體積及流速能直接影響發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣體積為200 μL時(shí)，可獲得最大的發(fā)光強(qiáng)度，所以實(shí)驗(yàn)選定的最佳進(jìn)樣體積為200 μL。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)光強(qiáng)度隨流速的增加而增大，但考慮到精確性與試劑用量，選擇4.20 mL/min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 反應(yīng)介質(zhì)的選擇 考察了常見的酸性介質(zhì)HCl、HNO3、H3PO4、多聚磷酸和H2SO4對(duì)該體系反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。研究表明，DPA在酸性環(huán)境中能產(chǎn)生微弱的化學(xué)發(fā)光，氫化可的松的加入能大大增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在H2SO4介質(zhì)中，體系的發(fā)光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，而在其它介質(zhì)中未觀察到明顯的發(fā)光信號(hào)，故選用H2SO4為反應(yīng)介質(zhì)。固定其它條件，考察0.05～2.0 mol/L H2SO4溶液對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。如圖4所示，隨著H2SO4濃度增大，氫化可的松的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度也增大； 當(dāng)H2SO4濃度達(dá)到1.0 mol/L時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值； 繼續(xù)增大H2SO4濃度，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度反而減小。因此，H2SO4溶液的最佳濃度選用1.0 mol/L。

3.2.3 DPA濃度的選擇 DPA在體系中是氧化劑，其濃度對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響很大。在5.0×10

1.0×10

3 mol/L范圍內(nèi)，考察了DPA溶液濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響。由圖5可見，當(dāng)DPA溶液濃度低于2.5×10

4 mol/L， 相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨DPA溶液濃度的增加而增大，當(dāng)其濃度達(dá)到2.5×10

4 mol/L時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大發(fā)光值； 繼續(xù)增大DPA的濃度，發(fā)光強(qiáng)度反而會(huì)減小，其原因可能是DPA為橘紅色溶液，濃度過大會(huì)導(dǎo)致自吸收。因此DPA溶液的濃度選用2.5×10

4 mol/L。

3.3 分析特性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，氫化可的松的質(zhì)量濃度在0.3 ～10 ng/mL范圍內(nèi)與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為I=7.62C-18.58 （ng/mL， R2=0.9991 ）。對(duì)濃度為50 ng/mL氫化可的松平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%。方法的檢出限為0.22 ng/mL。

3.4 干擾測(cè)定

在選定的最優(yōu)條件下，考察了人血清樣品中常見組分對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系的干擾情況，結(jié)果見表1。對(duì)于50 ng/mL氫化可的松，相對(duì)誤差小于5%的條件下，部分物質(zhì)及離子對(duì)氫化可的松的測(cè)定有一定的干擾，特別是尿酸和Cl

，故在對(duì)血清進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí)需要進(jìn)行樣品前處理。

3.5 樣品分析

標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)： 在0.5 mL血清樣品或注射液樣品中加入適量氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌混勻

3.5.1 注射液測(cè)定 將氫化可的松注射液（每管25 mg）用水稀釋至不同濃度，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)。由表2可知，氫化可的松的回收率在105.4%～125.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～2.7%之間。

3.5.2 血清樣品測(cè)定 將血清樣品按前述的方法處理，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，3個(gè)血清樣品中皆檢出了氫化可的松，氫化可的松的回收率在93.0%～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～3.2%之間。

3.6 化學(xué)發(fā)光機(jī)理探討

3.6.1 紫外可見吸收光譜圖研究 氫化可的松-DPA-H2SO4體系的紫外可見吸收光譜圖如圖6所示。DPA的吸收峰在364 nm處，當(dāng)加入H2SO4后，DPA溶液的顏色逐漸褪去，其吸收峰減弱，表明H2SO4與DPA發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。氫化可的松的吸收峰在249 nm處，當(dāng)其與DPA或DPA-H2SO4混合后，其紫外光譜明顯不同于氫化可的松和DPA或DPA-H2SO4紫外吸收光譜圖的簡(jiǎn)單加合，說明氫化可的松與DPA發(fā)生了反應(yīng)。

3.6.2 熒光光譜研究 在300～475 nm范圍內(nèi)，氫化可的松-DPA-H2SO4體系的熒光光譜圖見圖7。H2SO4和DPA在300～475 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均無熒光，但DPA存在基體光譜峰，兩者混合之后，DPA的基體光譜峰發(fā)生了明顯的變化，可推斷DPA與H2SO4可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。氫化可的松在紫外光激發(fā)下能產(chǎn)生特征熒光，其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為289 和361 nm； 當(dāng)其與H2SO4混合，由于酸效應(yīng)使熒

光發(fā)射峰強(qiáng)度降低，但無明顯位移，可以推斷H2SO4與氫化可的松之間并未產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)； 當(dāng)其與DPA混合時(shí)，僅在460 nm處產(chǎn)生一個(gè)弱發(fā)射峰，存在明顯的位移，由此可以推斷，DPA與氫化可的松發(fā)生了強(qiáng)的相互作用，這可能是反應(yīng)過程中產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)（O2）2*所引起的[25，26]。將DPA、H2SO4和氫化可的松三者混合所得到的熒光光譜也表明三者之間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)在反應(yīng)過程中可能產(chǎn)生了O2·

O2·

之間結(jié)合可能產(chǎn)生富電子中間體：激發(fā)態(tài)（O2）2*，（O2）2*返回基態(tài)生成O2[27，28]。

紫外可見光譜和熒光光譜測(cè)試表明，在H2SO4介質(zhì)中，DPA與氫化可的松發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，Shi等[29]的研究表明， DPA有兩種存在形式：[Ag（HIO6）2]5

和 [Ag（HIO6）（OH）（H2O）]2

（圖8），后者是活性中心并能發(fā)生復(fù)合反應(yīng)。氫化可的松分子可以獲得激發(fā)態(tài)（O2）2*的部分能量從而被激發(fā)。DPA-H2SO4-氫化可的松體系產(chǎn)生的發(fā)光可能來源于DPA和氫化可的松獲得（O2）2*的能量， 并被激發(fā)，返回基態(tài)時(shí)，能量以光的形式釋放，產(chǎn)生CL發(fā)射[25～28]。

4 結(jié) 論

本研究基于H2SO4介質(zhì)中氫化可的松對(duì)DPA信號(hào)的增強(qiáng)作用，提出了一種測(cè)定氫化可的松的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法。研究結(jié)果表明，本方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)際樣品分析。

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