范琳，王少君，李坤蘭

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咪唑類離子液體在纖維素酶降解纖維素體系中的作用

范琳，王少君，李坤蘭

（大連工業(yè)大學輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034）

以1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Emim]DEP）、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸（[Emim]Ac）為研究對象，考察兩種離子液體（IL）對酶法降解纖維素過程的影響。采用超聲輔助離子液體溶解纖維素，[Emim]DEP和[Emim]Ac分別使纖維素的結(jié)晶度降為53.6%和62.3%。在纖維素酶降解再生纖維素的過程中，當IL的加入量小于2.0%時，對酶解過程起促進作用，其中加入量為0.5%時，促進作用最強，酶解率分別提高了11.4%和17.5%。在最優(yōu)條件下（加入0.5%IL），測量纖維素酶系中各個酶的酶活，結(jié)果表明離子液體對β-葡萄糖苷酶起到了明顯的促進作用，分別使該酶酶活提高了120%和87%。離子液體降低了纖維二糖對葡聚糖外切酶的抑制作用，提高了酶解效率。

離子液體；纖維素；纖維素酶；溶解；降解

引 言

纖維素的綠色降解工藝是在纖維素酶作用下的酶解反應，但是由于纖維素分子間與分子內(nèi)氫鍵的大量存在，結(jié)晶度較高，不溶于水和普通有機溶劑，限制了纖維素的基礎研究和工業(yè)應用。研究表明，離子液體可以溶解纖維素，降低其結(jié)晶度，進而實現(xiàn)高效酶解反應得到葡萄糖[1]。葡萄糖可以轉(zhuǎn)化成乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原料，這對于解決目前的能源危機問題具有重要意義[2-3]。本研究應用1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Emim]DEP）、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸([Emim]Ac)兩種離子液體，借助超聲輔助分別將纖維素溶解，用纖維素酶降解再生后的纖維素，采用DNS比色法，通過測量在降解體系中加入不同量的離子液體時體系中還原糖的濃度來反映離子液體對降解體系的影響，歸納總結(jié)出離子液體對纖維素酶混合酶系中各個酶的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

微晶纖維素（結(jié)晶度為80.6%），美國FMC。纖維素酶，國藥集團化學試劑有限公司。[Emim]Ac[4]、[Emim]DEP[4]、DNS[5]等試劑均為實驗室自制。

1.2 實驗儀器

D/Max-3B型X射線衍射儀，日立Hitachi公司；JEOL JSM-6460LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；ACE超聲化學反應系統(tǒng)，美國Sonics公司；12-POLS型偏光顯微鏡，日本Olympus公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 纖維素的溶解及再生 將微晶纖維素和離子液體以1:20的比例置于超聲瓶中混合，在超聲輔助條件下（探頭溫度90℃，功率40%，循環(huán)水溫度70℃）充分溶解3 h[6]。溶解完全后，加入適量去離子水，反復沖洗沉降后得到再生纖維素，冷凍干燥24h，待用[7]。以偏光顯微鏡、X射線衍射儀（XRD）等儀器，從形貌、晶型狀態(tài)等方面描述纖維素溶解變化過程。

1.3.2 纖維素的酶解 配制100ml HAc-NaAc緩沖溶液[8]，加入1 g纖維素酶制成酶液待用。取40 ml酶液，先后加入0.1 g纖維素和不同濃度的離子液體。在50℃、120 r·min-1條件下反應8 h后離心得上清液。采用DNS法測定上清液中還原糖含量[9]，進而計算出酶解率。

1.3.3 酶活的測定 按照國際理論應用化學協(xié)會（IUPAC）推薦的國際標準方法分別測定纖維素總酶活（濾紙酶活）、葡聚糖內(nèi)切酶酶活、葡聚糖外切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活[10]。在4個100ml錐形瓶中分別加入40 ml纖維素酶液、底物（1 cm× 6 cm whatman No.1濾紙條，1%羧甲基纖維素鈉，1%微晶纖維素，1%水楊苷）、0.5%離子液體（[Emim]Ac、[Emim]DEP）。置于50℃的恒溫水浴振蕩反應器中，120 r·min-1恒溫反應60 min。用20 ml滅活的纖維素酶液作空白，采用DNS法測定體系中還原糖的含量，進而計算出酶活。

1.4 計算公式

結(jié)晶指數(shù)[11]計算公式為

式中，200為222.7°處的峰值；AM為218°處的峰值。

酶解率[12]計算公式為

式中，為還原糖的質(zhì)量，g；為纖維素的質(zhì)量，g；為纖維素的含水率，%。

纖維素酶活的定義：在特定條件下，單位質(zhì)量的酶每分鐘催化相應的底物纖維素水解成l μmol葡萄糖，稱為一個酶活單位即1 U·g-1[12]。計算公 式為

酶活（U·g-1）(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素的溶解

2.1.1 偏光顯微鏡分析 由圖1、圖2可知，在超聲輔助條件下，隨著時間的延長，纖維素在兩種離子液體中逐漸溶解，3 h后，纖維素完全溶解。在相同時間，[Emim]Ac體系在偏光鏡下更明亮，說明未溶解的部分更多，因此，[Emim]DEP比[Emim]Ac溶解纖維素的能力更強。

2.1.2 XRD分析 由圖3可知，對于未處理纖維素，其結(jié)晶程度大，衍射峰尖銳，屬于典型的纖維素Ⅰ型[13]。經(jīng)兩種離子液體處理后，峰形不再尖銳明顯，而是變成一組強度很低分布很寬的衍射峰，這與纖維素Ⅱ型相符，說明離子液體處理后纖維素的結(jié)構(gòu)由Ⅰ型轉(zhuǎn)變成了Ⅱ型[14-15]。并且，經(jīng)[Emim]DEP處理后的纖維素衍射峰比[Emim]Ac更平滑、分布更寬，進一步說明[Emim]DEP溶解纖維素的能力更強。

2.1.3 結(jié)晶指數(shù)分析 由表1可知，經(jīng)兩種離子液體處理后，纖維素的結(jié)晶指數(shù)大大降低，為后來纖維素酶解提供更多更好的作用位點，有利于下一步酶解反應的進行。

2.1.4 再生率分析 分別用[Emim]DEP和[Emim]Ac兩種離子液體溶解1 g微晶纖維素，經(jīng)反復沖洗、沉降、過濾、干燥后可以得到0.88 g和0.93 g的再

圖3 [Emim]Ac和[Emim]DEP處理前后纖維素的XRD譜圖

表1 不同離子液體處理前后纖維素結(jié)晶指數(shù)的變化

生纖維素，再生率分別為88%和93%。說明部分被溶解的纖維素無法全部再生，經(jīng)[Emim]Ac處理的纖維素再生率比[Emim]DEP高，進一步說明[Emim]DEP溶解纖維素的能力比[Emim]Ac更強。

2.2 纖維素的酶解

利用溶解效果相對較好的[Emim]DEP處理微晶纖維素，反復沖洗沉降后得到結(jié)晶指數(shù)均為53.6%的再生纖維素，準確稱取13份質(zhì)量為0.1g的再生纖維素，加入酶液和不同質(zhì)量分數(shù)的兩種離子液體，結(jié)果如圖4所示。隨著兩種離子液體加入量的增加，酶解率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。加入量小于2.0%時，離子液體對酶解過程起促進作用。其中，加入量為0.5%時，對酶解過程的促進作用最強，[Emim]Ac和[Emim]DEP分別可以使酶解率提高11.4%和17.5%，且在相同加入量條件下，[Emim]DEP對酶解過程的促進作用強于[Emim]Ac。

2.3 離子液體對纖維素酶系中各個酶的作用與分析

由圖5可以看出，當分別向纖維素的酶解體系中加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的兩種離子液體時，纖維素酶的總酶活都有所提高。[Emim]Ac和[Emim]DEP分別使β-葡萄糖苷酶的酶活提高了87%和120%，使葡聚糖外切酶的酶活提高了39%和51%，而加入離子液體對于葡聚糖內(nèi)切酶的影響不大。其中，

圖4 加入不同量的IL時纖維素的酶解情況

圖5 加入0.5%IL時纖維素酶系中各個酶的酶活

[Emim]DEP對纖維素酶系中3種酶的促進作用強于[Emim]Ac。

纖維素酶是由多種酶混合組成的，具有協(xié)同作用的復雜酶系，根據(jù)酶功能的不同，纖維素酶主要分為3種組分：葡聚糖內(nèi)切酶(EC)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)[16]。其中，葡聚糖內(nèi)切酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機切斷纖維素長鏈的β-1,4-糖苷鍵，生成纖維寡糖、纖維三糖或纖維二糖等長度不等的短鏈低聚糖。葡聚糖外切酶由催化域（CD）和吸附域（CBD）兩部分構(gòu) 成[17]，主要作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，可破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)并從纖維素長鏈的非還原端逐一水解出纖維二糖。β-葡萄糖苷酶主要用于水解反應中生成的纖維二糖，使其最終變?yōu)槠咸烟荹18]。

在整個降解的過程中，由于CBH的活性中心呈狹長的隧道狀深陷于催化域的內(nèi)部，只有單鏈纖維素分子能夠進入。CBD具有吸附在纖維素表面并從結(jié)晶纖維素表面分離出纖維素單鏈的作用，所以CBD能否在酶解過程中高效地進行吸附分離作用是提高纖維素酶降解纖維素速率的決定因素[19]。然而，當生成的纖維二糖不能被及時分解時，大量的纖維素二糖會吸附在CBH上，使酶分子構(gòu)像發(fā)生變化，CBD無法進行有效吸附，致使CD缺少底物而不能發(fā)生作用[20]。另外纖維二糖在活性中心附近與色氨酸結(jié)合產(chǎn)生空間位阻效應，阻塞了狹窄的活性中心隧道，使單根纖維素分子鏈難以進入發(fā)生水解作用[21]。有研究表明[22]，當CBH吸附微晶纖維素時，表現(xiàn)為分子間氫鍵強度的減弱。CBH的吸附并未影響天然纖維素的指紋區(qū)各譜帶形狀、位置和強度的變化，表明吸附只涉及纖維的表面而未影響CC，CO等纖維素分子骨架的結(jié)構(gòu)，但它可導致微纖維束和基元纖維的分離，這是分子鏈間氫鍵結(jié)合力減弱的結(jié)果，可為水解作用的進行提供條件。但是CBH與纖維二糖結(jié)合后，再吸附微晶纖維素時，卻導致了與上述完全不同的變化，纖維素氫鍵區(qū)的吸收強度反而增強，微纖維束和基元纖維無法分離，而游離的基元纖維的存在是纖維素酶完成催化水解作用的必需條件，因此水解過程受到抑制。當在水解體系中加入一定濃度的離子液體時，離子液體中的陰離子充當電子給予體，陽離子充當電子接受體，與纖維素中H原子和O原子相互作用，降低纖維素分子間的氫鍵強度，減輕體系中纖維二糖對CBH的反饋抑制作用，提高β-葡萄糖苷酶的酶活，使吸附催化過程高效進行，進而提高了酶解效率。含有不同陰離子的咪唑類離子液體破壞纖維素中氫鍵的能力不同，提高酶解率的效果也就不同，實驗結(jié)果表明，[Emim]DEP對纖維素酶解過程的促進作用強于[Emim]Ac。

3 結(jié) 論

（1）采用超聲輔助方法，從形貌上（偏光顯微鏡）、晶型（XRD）上研究了兩種離子液體[Emim]DEP和[Emim]A對纖維素溶解過程的影響，證明離子液體對溶解過程起到促進的作用，分別使纖維素的結(jié)晶度降為53.6%和62.3%。

（2）研究了IL加入量對纖維素酶降解再生纖維素過程的影響，發(fā)現(xiàn)隨著IL加入量的增加，酶解率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在加入量為0.5%時，促進作用最強，酶解率分別提高了11.4%和17.5%。且加入量小于2.0%時，IL對酶解過程起促進作用，加入量大于2.0%時，酶解率趨于平緩。

（3）在最優(yōu)條件下（加入0.5%IL），測量纖維素酶系中各個酶的酶活，結(jié)果表明離子液體對β-葡萄糖苷酶起到了明顯的促進作用，分別使該酶酶活提高了120%和87%。離子液體通過提高β-葡萄糖苷酶的酶活使過量的纖維二糖及時水解為葡萄糖，減輕體系中纖維二糖對CBH的反饋抑制作用，使吸附催化過程高效進行，進而提高了酶解效率。

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Function of imidazolium-based ionic liquids in system of enzymatic
degradation of cellulose

FAN Lin, WANG Shaojun, LI Kunlan

(School of Light Industry & Chemical Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, Liaoning, China)

Taking 1-ethyl-3-methylimidazolium diethyl phosphate ([Emim]DEP) and 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([Emim]Ac) as research targets, the influence of the two ionic liquids (IL) on the process of enzymatic degradation of cellulose was investigated. By using ultrasound to assist ionic liquids in dissolving cellulose, [Emim]DEP and [Emim]Ac made the crystallinity of cellulose decrease to 53.6% and 62.3% respectively. In the process of enzymatic degradation of regenerated cellulose, when the dosage of IL was less than 2.0%, IL acted as promoter, and when the dosage of IL was 0.5%, the promoting effect of IL was the strongest. Enzymatic hydrolysis rate increased by 11.4% and 17.5% respectively. Under the optimal conditions (add in 0.5% IL), the enzyme activities of every enzyme in the cellulose system were measured. Ionic liquids had an obvious promoting effect on β-glucosidase, increasing enzyme activity by 120% and 87% respectively. Ionic liquids reduced inhibition of exoglucanase by cellubiose, and improved efficiency of enzymatic degradation of cellulose.

ionic liquids; cellulose; cellulase; dissolution; degradation

date: 2014-07-15.

Prof. WANG Shaojun, wgsoju@163.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20141062

TQ 352.2

A

0438—1157（2015）01—0121—05

國家自然科學基金項目（21106011）。

2014-07-15收到初稿，2014-09-22收到修改稿。

聯(lián)系人：王少君。第一作者：范琳（1989—），女，碩士研究生。

supported by the National Natural Science Foundation of China (21106011).