戴 兵， 徐 俐， 金海東， 蔡寧宇， 陳 輝， 李 斌， 蔡建武， 潘 駿△

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院，2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江溫州325027)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以局灶性關(guān)節(jié)軟骨退行性病變、骨丟失、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成及關(guān)節(jié)畸形和軟骨下骨質(zhì)硬化為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人，女性多于男性。當(dāng)今尚未發(fā)現(xiàn)治療骨關(guān)節(jié)炎的滿意治療方法，一般都是僅僅給予對癥治療，臨床上應(yīng)用最多的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)又常引起胃腸消化道出血以及心血管等諸多方面的副作用。研究報(bào)道天然植物化學(xué)物質(zhì)由于其安全、有效、經(jīng)濟(jì)、副作用小而具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景，為治療炎癥如OA等，提供了新的方向［1］。國內(nèi)外流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，以食用橄欖油為主的人群，乳腺癌、胃癌、腸癌和及慢性炎癥疾病的發(fā)病率很低［2］。橄欖油存在大量酚類化合物，如橄欖苦苷(oleuropein，OL)，因?yàn)槠渚哂薪档脱?，減少動脈粥樣硬化［3］以及抗炎作用［4］引起相當(dāng)大的關(guān)注。一些研究還表明，橄欖油酚類化合物具有強(qiáng)大的抗氧化活性［5］和防止氧介導(dǎo)的細(xì)胞損傷反應(yīng)的作用［6］。在這些前人研究的基礎(chǔ)上，本研究通過研究橄欖苦苷對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響，探討橄欖苦苷對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1 動物和材料

健康雄性2周齡SD大鼠8只，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，有關(guān)動物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容通過了溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審批。

橄欖苦苷購自Sigma;DMEM和胎牛血清購自Gibco;抗生素和抗真菌劑溶液購自Life Technologies;抗 COX2、p65、p-p65、IκBα 和 p-IκBα 抗體購自CST;抗iNOS和GAPDH抗體購自Bioworld Technology;NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所;PGE-2 ELISA試劑盒購自R＆D。所用引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2 方法

2.1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌操作下分離2周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)的軟骨，剔除周圍組織，將軟骨塊剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小;選用酶2步消化法獲得軟骨細(xì)胞，加入含10% 胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每3～4 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，0.25%胰酶/0.1%EDTA 消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養(yǎng)。

2.2 蛋白多糖和Ⅱ型膠原的檢測 取第3代細(xì)胞，制成細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長至70% ～80%，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗。室溫1%阿爾新蘭溶液染色40 min，雙蒸水沖洗，自然干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白多糖的表達(dá)情況。

另取細(xì)胞爬片于3%H2O2中室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗;正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育20 min，PBS沖洗;滴加I抗(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS沖洗;滴加 II抗工作液，37℃濕盒中孵育30 min，PBS沖洗;滴加DAB顯色1 min，PBS沖洗;蘇木素復(fù)染，流水沖洗30 min;封片，鏡下觀察Ⅱ型膠原的顯色情況。

2.3 橄欖苦苷對大鼠軟骨細(xì)胞活性的影響 取生長良好的第3代軟骨細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱;細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，吸棄培養(yǎng)基，分別加入含藥物的 DMEM培養(yǎng)基(不含胎牛血清)200 μL，藥物的最終濃度分別為0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和 100 μmol/L。培養(yǎng) 24 h后，小心吸去上清，按照說明書每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃避光孵育1 h。酶標(biāo)儀上測定樣本450 nm的光吸收值(A)。計(jì)算每種藥物濃度組光吸收值的平均值，分別與空白對照組比較。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 取第3代原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照(control)組(只加培養(yǎng)基)、IL-1β組(IL-1β 10 μg/L)、IL-1β +OL 組(其中，IL-1β 濃度為10 μg/L，橄欖苦苷分別為 10、50、100 μmol/L)。

2.5 細(xì)胞上清液中一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)含量的測定 各組細(xì)胞加入不同劑量的橄欖苦苷干預(yù)2 h后加入IL-1β。將培養(yǎng)板置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，4℃、2 000 r/min離心5 min去除細(xì)胞碎片，輕輕吸取上清液，按照說明書在550 nm和0.5 cm光徑下測紫外分光光度計(jì)下各管吸光度值。NO含量=(測定管A值－空白管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值－空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

設(shè)置樣本組和標(biāo)準(zhǔn)品組，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加50 μL不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;樣品組加10 μL上清液和40 μL稀釋液;樣本組和標(biāo)準(zhǔn)品組均加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，封板膜封板，37℃恒溫1 h;棄去上清液，加洗滌液洗滌，加入底物 A、B各 50 μL，37 ℃恒溫避光15 min;加入終止液50 μL/well，450 nm處測定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品求出標(biāo)準(zhǔn)方程，然后計(jì)算各組PGE2含量。

2.6 橄欖苦苷對軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1和 MMP-13表達(dá)的影響 收集各組細(xì)胞，總RNA抽提按TRIzol試劑說明書操作，分光光度計(jì)測量RNA的純度及濃度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進(jìn)行PCR，各樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件如下:95℃ 2 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃20 s，循環(huán)40 次。

2.7 橄欖苦苷對經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的SD大鼠軟骨細(xì)胞環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及核因子 κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路蛋白的影響冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍，冰上裂解細(xì)胞、離心并收集上清后行蛋白定量，采用10%SDS-PAGE。蛋白分離后經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉1 h，與β2M抗體4℃孵育過夜后，次日加入II抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3組以上的組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 軟骨細(xì)胞的鑒定

顯微鏡下見軟骨細(xì)胞貼壁生長，呈現(xiàn)三角形或不規(guī)則多角形。軟骨細(xì)胞經(jīng)過阿爾新藍(lán)染色后，可見蛋白多糖藍(lán)色顆粒。在Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞質(zhì)呈黃色，細(xì)胞核呈紫色，見圖1。

2 各濃度藥物對細(xì)胞活性的作用

在本研究所采用的藥物濃度范圍內(nèi)，3種藥物濃度對軟骨細(xì)胞的活性均無明顯抑制作用，與對照組相比差異不顯著，見圖2。

Figure 1.A:alcian blue staining(×100);B:type II collagen immunohistochemical staining(×40).圖1 軟骨細(xì)胞的鑒定

Figure 2.The effect of oleuropein on the cell viability in the chondrocytes was assessed by CCK-8 assay.Mean ±SD.n=3.圖2 橄欖苦苷對軟骨細(xì)胞活性的影響

3 橄欖苦苷對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞NO和PGE2的影響

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞橄欖苦苷(0、10、50或100 μmol/L)預(yù)處理2 h 后，加入IL-1β(10 μg/L)刺激24 h，與無IL-1β刺激的對照組相比，NO和PGE2均有顯著增加(P＜0.01)。橄欖苦苷以濃度梯度依賴的方式抑制 IL-1β刺激引起的 PGE2的升高(P＜0.05)。此外，橄欖苦苷還能以濃度依賴方式抑制IL-1β刺激引起的NO的升高(P＜0.05)，見圖3。

4 橄欖苦苷對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

IL-1β作用下，與對照組相比，MMP-1和MMP-13 mRNA的表達(dá)量增加(P＜0.05)。橄欖苦苷預(yù)處理后，顯著抑制MMP-1和MMP-13在mRNA水平的表達(dá)且濃度越高抑制效果越顯著，不同濃度的橄欖苦苷組間具有明顯差異(P＜0.05)，見圖4。

5 橄欖苦苷對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of oleuropein(OL)on NO and PGE2productions in the chondrocytes with different treatments.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖3 橄欖苦苷對NO和PGE2的影響

COX-2和iNOS蛋白的表達(dá)通過Western blotting測定，結(jié)果如圖顯示，IL-1β可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成COX-2和iNOS，而橄欖苦苷可以抑制COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的上調(diào)，見圖5。

6 橄欖苦苷抑制NF-κB的激活

NF-κB的通路活化在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用，可以上調(diào) COX-2和iNOS的表達(dá)。IL-1β刺激后，可以激活NF-κB信號通路，磷酸化并降解IκBα。同時，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB p65亞基在細(xì)胞核中表達(dá)增加而在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)下降。相反，預(yù)處理橄欖苦苷(10、50、100 μmol/L)后可以抑制 IκBα 磷酸化和p65亞基從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，見圖6。

討 論

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)是由白細(xì)胞分泌的一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的因子，家族十分龐大，如今己被發(fā)現(xiàn)并命名的就高達(dá)33種?，F(xiàn)在己知的和軟骨損傷有關(guān)的白細(xì)胞介素因子有IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17 等，其中的 IL-1 的亞型 IL-1β是最基本的因素。已有證據(jù)表明，IL-1β能夠影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的基質(zhì)的合成，在整個OA病變中發(fā)揮的重要作用［7］。IL-1β是一種主要的關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)退變的代謝調(diào)節(jié)因子［8］，與軟骨破裂，基質(zhì)降解密切相關(guān)。它可以上調(diào)iNOS、COX-2、PGE2和 IL-6等炎癥因子和軟骨退變相關(guān)基因的表達(dá)［9］。

Figure 4.The mRNA expression of MMP-1 and MMP-13 in the chondrocytes with different treatments determined by real-time PCR analysis.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖4 MMP-1和MMP-13的real-time PCR檢測結(jié)果

IL-1β可以激活NO和PGE2的生成和釋放，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子的變化，引起OA的發(fā)生發(fā)展，是促成骨關(guān)節(jié)病一個關(guān)鍵的原因［10］。NO是一種短期效應(yīng)的信號分子，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能強(qiáng)烈地抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖，使軟骨的胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)解離，無法維持正常的形態(tài)和功能。目前，已經(jīng)確定的NOS有神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)和iNOS 3種。iNOS是NOS的誘導(dǎo)型，在關(guān)節(jié)軟骨中起作用的主要是iNOS，它容易被激活產(chǎn)生大量的NO而造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷。研究表明在OA發(fā)生發(fā)展過程中，iNOS對NO的合成及其生物功能的發(fā)揮具有重要意義，體外實(shí)驗(yàn)中NO、iNOS在骨關(guān)節(jié)液、血清中均有明顯表達(dá)，關(guān)節(jié)液、血清中NO、iNOS水平顯著高于正常組［11］，多項(xiàng)研究表明使用iNOS抑制劑能明顯減輕OA軟骨的損傷程度［12-13］.在本研究中，我們證明了橄欖苦苷能有效抑制關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NO的產(chǎn)生及iNOS在蛋白水平的表達(dá)，這與Zhang等［14］的研究結(jié)果一致。

Figure 5.The protein expression of COX-2 and iNOS in the chondrocytes with different treatments determined by Western blotting.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 COX-2和iNOS的Western blotting結(jié)果

IL-1β促進(jìn)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞合成并釋放的PGE2和膠原酶產(chǎn)生強(qiáng)大的促炎癥作用［15］。前列腺素在化學(xué)本質(zhì)上是一種脂肪酸，是由COXs合成的前列素類化合物，COX-2是最可能引起關(guān)節(jié)炎中PGE2水平上升的相關(guān)酶類［16］。在生理功能上PGE2可以是一種炎癥介質(zhì)或是一種局部激素，引起滑膜炎癥和骨的吸收。PGE2含量的改變將導(dǎo)致關(guān)節(jié)間的多種組織的基質(zhì)合成發(fā)生改變。特別是促進(jìn)骨吸收的作用最強(qiáng)，可激活破骨細(xì)胞，破壞骨與軟骨，且可激惹血管新生，在關(guān)節(jié)炎病理及關(guān)節(jié)破壞中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，加入IL-1β的細(xì)胞上清液中PGE2的濃度明顯高于對照組，提示IL-1β能夠明顯提高PGE2的含量，加重對軟骨細(xì)胞的損害。再次證實(shí)IL-1β在OA軟骨細(xì)胞的破壞、OA的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生PGE2的過程中起了重要作用。同時，橄欖苦苷能以濃度依賴方式減少IL-1β刺激引起的PGE2的升高以及COX-2在蛋白水平的表達(dá)。

Figure 6.The effect of oleuropein on the protein levels of the molecules in the NF-κB signaling pathway in the chondrocytes with different treatments.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖6 NF-κB通路相關(guān)蛋白Western blotting結(jié)果

IL-1β可引起膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素等各種MMP的酶原合成、分泌及其活性增加，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解來實(shí)現(xiàn)對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分解代謝的影響［17-19］，尤其是增加 MMP-1和 MMP-13等的合成，打破了基質(zhì)金屬蛋白酶-金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的平衡，從而促進(jìn)基質(zhì)大分子降解［20-21］。本研究用10 μg/L IL-1β誘導(dǎo)，通過real-time PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MMP-1和MMP-13的表達(dá)量明顯增加。在此基礎(chǔ)上，將橄欖苦苷作用于 IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) MMP-1、MMP-3和MMP-13的表達(dá)量明顯下降，揭示了橄欖苦苷對OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

NF-κB 在炎癥過程中發(fā)揮重要作用［22］。NF-κB通過調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生物進(jìn)程。大量研究表明，IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)是通過NF-κB來介導(dǎo)的，在靜息狀態(tài)下，IκBα 與 NF-κB的p65、p50兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)上游信號(通常是由MyD88介導(dǎo)的TLR4/NF-κB 信號通路)激活I(lǐng)κB 激酶后，活化的 IκB 激酶會泛素化、磷酸化并降解 IκBα，使得NF-κB 2個亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)(尤其是p65亞單位)，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥，包括iNOS和COX-2［23-25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可以抑制因IL-1β誘導(dǎo)而引起的IκBα的降解。據(jù)此，我們推測橄欖苦苷通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路而產(chǎn)生抗炎作用。由于橄欖苦苷對體外軟骨細(xì)胞作用的結(jié)果不能完全代表體內(nèi)，在動物模型中是否有同樣的效果仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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