曾振華，黃秋菊，黃金賢，舒朝輝，劉培慶，陳少銳，劉　冰，周四桂△(廣東藥學院臨床藥學系，中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東廣州50006)

短鏈酰基輔酶A脫氫酶在心肌細胞凋亡中的作用*

曾振華1，黃秋菊1，黃金賢1，舒朝輝1，劉培慶2，陳少銳2，劉冰1，周四桂1△
(1廣東藥學院臨床藥學系，2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東廣州510006)

［摘要］目的:研究短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)在心肌細胞凋亡中的變化，探討其與心肌細胞凋亡之間的關系。方法:以叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)刺激心肌細胞建立凋亡模型。檢測細胞存活率、SCAD mRNA和蛋白表達、SCAD活性以及游離脂肪酸含量變化;并采用SCAD的最優(yōu)干擾序列siRNA-1186進行干擾，觀察其對心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果:與對照組相比，在tBHP誘導的心肌細胞凋亡模型中，SCAD的mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)。與陰性對照序列組相比，siRNA-1186干擾后心肌細胞的SCAD表達和活性明顯下降，心肌細胞游離脂肪酸含量明顯增加，同時，心肌細胞出現(xiàn)了明顯凋亡，與tBHP誘導的心肌細胞凋亡趨勢一致。結(jié)論: SCAD表達失調(diào)可能參與心肌細胞凋亡的過程，上調(diào)SCAD可能成為干預心肌細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。

［關鍵詞］短鏈?；o酶A脫氫酶;心肌細胞;細胞凋亡;心力衰竭;能量代謝;叔丁基過氧化氫

［修回日期］2015-05-12

細胞凋亡是細胞在生理或病理條件下主動結(jié)束生命的過程，又稱程序性細胞死亡，它在心臟發(fā)育和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［1-2］。研究表明，心肌細胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)化的重要機制，在肥大后期，由于心肌細胞的不斷丟失，使心肌組織合胞體的功能逐漸受損，心功能逐漸降低，最終導致心力衰竭［3］。然而，誘發(fā)心肌細胞凋亡的相關因素及線粒體在心肌細胞凋亡中的作用機制尚未完全闡明。

心肌是耗能最多的組織之一。正常心肌能量的60%～90%由脂肪酸氧化提供［4］。因此，線粒體脂肪酸β氧化對于維持心肌能量代謝有重要意義。但是，心力衰竭時，心肌底物利用和能量代謝發(fā)生改變，即心肌的“代謝重構(gòu)”［5］。心力衰竭初期，能量代謝底物從脂肪酸轉(zhuǎn)化成葡萄糖優(yōu)先利用，可以避免衰竭心臟發(fā)展至不可逆損傷的狀態(tài);心力衰竭后期，整個葡萄糖和脂肪酸的代謝速率均下降，使心肌出現(xiàn)能量缺乏，最終導致心臟功能紊亂［6］。

短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)是?；o酶A脫氫酶家族中的一員，特異性地分解短鏈?；o酶A底物，是脂肪酸β氧化的第一個限速步驟，是脂肪酸氧化的關鍵酶［7］。生理情況下，進入線粒體的?；o酶A在相應的脫氫酶作用下脫氫，開始脂肪酸β氧化循環(huán)，從而產(chǎn)生大量能量，供給心肌需要［8］。

在前期研究中，我們采用定量蛋白質(zhì)組學技術比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達明顯降低［9］。進一步研究顯示，在病理性心肌肥大的體內(nèi)外模型中SCAD的表達和酶活性均顯著下降。此外，采用siRNA對SCAD進行干擾，心肌細胞出現(xiàn)了明顯的病理性肥大，表明SCAD的表達失調(diào)在病理性心肌肥大中具有重要意義［10-11］。然而，SCAD在心肌細胞凋亡中的作用尚不清楚。

本研究以叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)建立細胞凋亡模型，觀察SCAD在心肌細胞凋亡中的變化，從心肌能量代謝的視角來探討心肌細胞凋亡的發(fā)病機制，以期為心力衰竭尋找新的分子標志物，并為心力衰竭治療尋找新的藥物作用靶點。

材料和方法

1材料

RT-PCR測定試劑盒和TRIzol和SYBR Green購于TaKaRa; BCA蛋白定量試劑盒和Western blot發(fā)光液購于Thermo;細胞SCAD活性比色法定量檢測試劑盒購于上海杰美基因;單克隆鼠抗α-tubulin、叔丁基過氧化氫購于Sigma;單克隆兔抗SCAD購于Abcam; Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于凱基。

2方法

2.1乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)采用乳鼠心肌細胞改良法分離并培養(yǎng)心肌細胞，取1～3 d SD乳鼠心臟，0.08%胰蛋白酶冰上冷消化20 min后，37℃恒溫水浴消化4 min，多次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液，收集細胞沉淀重懸后差速貼壁1 h去除成纖維細胞，取上清調(diào)節(jié)細胞密度接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入BrdU(0.1 mmol/L)抑制成纖維細胞生長。按照上述方法分離制備的心肌細胞，經(jīng)α-actin抗體的免疫細胞化學染色，純度可達95%以上，符合實驗要求。

2.2tBHP處理心肌細胞選取正常培養(yǎng)2～3 d的心肌細胞用于實驗，用不同濃度的tBHP刺激心肌細胞不同時間，以研究tBHP對心肌細胞凋亡的誘導及其與SCAD表達的量效及時效關系。

2.3心肌細胞活力的檢測用MTT比色法測定心肌細胞活力。按照每孔5×104的濃度將心肌細胞接種于96孔板，按實驗分組給予相應的處理因素，每組設6個復孔。處理終止后吸去原培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(濃度為5 g/L) 20 μL，于5% CO2、37℃繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL的DMSO，搖床上振蕩10 min使藍紫色結(jié)晶甲臜充分溶解，在酶標儀570 nm處測其A值并計算各組細胞存活率。

2.4Real-time PCR檢測mRNA的表達按照TRIzol說明書步驟提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA樣品的260和280 nm波長下的A值，檢測純度并計算出RNA的濃度。參照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應。按照SYBR Green說明書反應體系加入熒光染料、引物和RT產(chǎn)物后在Bio-Rad IQ5 PCR儀中進行real-time PCR反應。反應程序為: 95℃10 s，90℃5 s，循環(huán)50次; 95℃15 s，60 ℃1 h，65℃30 s，循環(huán)61次。引物由上海生工合成，序列見表1。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1.The primers for the real-time PCR amplification

2.5Western blot法檢測蛋白表達提取各組心肌細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10% SDS分離膠和5%濃縮膠進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Bio-Rad)，室溫封閉1 h后加入Ⅰ抗(SCAD，1∶1 000;αtubulin，1∶10 000)過夜。漂洗后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，化學發(fā)光試劑增強反應，X線壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

2.6SCAD活性的檢測按照實驗分組處理細胞，收集細胞后置于冰上裂解30 min，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。酶活性檢測是基于2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenol indophenol，DCPIP)作為人工電子受體，替代黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)，在SCAD的作用下，由短鏈脂酰輔酶A提供的電子，經(jīng)過硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate，PMS)的傳遞，被還原為無色產(chǎn)物，通過分光光度儀的峰值變化(600 nm波長)來定量分析SCAD的活性。嚴格按照說明書采用酶標儀法進行檢測。

2.7流式細胞術檢測細胞凋亡用0.25%不含EDTA胰酶消化貼壁心肌細胞，1 000 r/min，5 min離心收集細胞，用PBS漂洗細胞2次，用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞并調(diào)整細胞濃度。應用Annexin V/PI試劑盒進行雙標。應用流式細胞儀檢測心肌細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻情況，計算凋亡細胞的百分比。

2.8siRNA干擾siRNA干擾序列購于上海吉瑪制藥技術有限公司。采用本實驗室篩選出的最優(yōu)干擾序列siRNA-1186進行實驗，轉(zhuǎn)染方法按照公司提供的轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。具體siRNA序列見表2。

表2　siRNA核酸序列Table 2.The primer sequences of siRNA

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用單因素方差分析。并運用Bonferroni t檢驗進行組間兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 tBHP對心肌細胞存活率的影響

MTT比色法檢測不同濃度tBHP(0、50、100、200、300和400 μmol/L)干預心肌細胞6 h后，細胞活力明顯降低，且呈濃度依賴性;用200 μmol/L tBHP處理不同時間(0、1、2、6和8 h)，發(fā)現(xiàn)細胞存活率也隨時間的延長逐漸下降。當200 μmol/L tBHP作用6 h時細胞存活率約為50%，因此后續(xù)的RNA干擾實驗采用200 μmol/L tBHP作用6 h進行研究，見圖1。

2心肌細胞凋亡模型中SCAD的mRNA以及蛋白的表達變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，隨著tBHP處理濃度和時間的增加，心肌細胞內(nèi)SCAD的mRNA表達明顯下降，見圖2。Western blot的結(jié)果顯示出與real-time PCR結(jié)果相一致的趨勢，SCAD的蛋白表達均有下降，以濃度為200 μmol/L作用6 h和8 h時，SCAD的表達下降更為顯著(P＜0.01)，見圖3。

Figure 1.The viability of tBHP-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON.圖1各組心肌細胞存活率的變化

Figure 2.The mRNA expression of SCAD in tBHP-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON.圖2 tBHP刺激后心肌細胞SCAD的mRNA表達

Figure 3.The protein expression of SCAD in tBHP-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON.圖3 tBHP刺激后心肌細胞SCAD蛋白的表達變化

3 siRNA干擾序列的篩選結(jié)果

由圖4可見，與空白對照和陰性對照組相比較，3條干擾序列siRNA-1186、siRNA-744和siRNA-207均可不同程度地降低SCAD的蛋白及mRNA表達，其中以siRNA-1186的降低程度最明顯。這一趨勢與SCAD活性檢測結(jié)果的趨勢一致，siRNA-1186組的SCAD活性相對于對照組的活性最低。因此，選擇1186干擾序列進行后續(xù)研究。

Figure 4.Selection of the siRNA sequences in the cardiomyocytes.NC: negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON.圖4 siRNA篩選結(jié)果

4 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎婊盥屎偷蛲雎实挠绊?/p>

由圖5可見，1186干擾序列通過瞬時轉(zhuǎn)染對SCAD基因表達進行干擾后，心肌細胞存活率顯著降低，心肌細胞出現(xiàn)了明顯凋亡，其程度與刺激因素tBHP誘導的心肌細胞凋亡趨勢一致。這表明SCAD在心肌細胞凋亡過程中可能具有重要作用，其表達量的降低可能是造成心肌細胞凋亡的一個重要因素。

5 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎鸖CAD表達、SCAD活性及游離脂肪酸含量的影響

mRNA、蛋白表達以及酶活性水平結(jié)果均顯示siRNA干擾可以明顯減少心肌細胞SCAD的表達量，降低SCAD的活性。此外，心肌細胞對脂肪酸的氧化能力明顯降低，心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著增多，SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與tBHP誘導心肌細胞凋亡導致的脂質(zhì)變化一致，見圖6。表明SCAD的表達下調(diào)可能導致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力下降，從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加，導致心肌細胞凋亡發(fā)生。

Figure 5.The changes of the viability and apopototsis of the cardiomyocytes treated with tBHP (200 μmol/L，6 h) or siRNA-1186 (48～72 h).NC: negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON;##P＜0.01 vs NC.圖5 siRNA-1186或tBHP誘導的心肌細胞凋亡模型中細胞存活率和凋亡率的變化

Figure 6.The expression and activity of SCAD and the content of free fatty acids in cardiomyocytes treated with tBHP (200 μmol/L，6 h) or siRNA-1186 (48～72 h).Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CON;##P＜0.01 vs NC.圖6 siRNA-1186或tBHP誘導的凋亡模型中心肌細胞SCAD表達、SCAD活性及游離脂肪酸的變化

討論

凋亡是在基因控制下一種程序性細胞死亡，能維持正常組織形態(tài)和功能。細胞凋亡是機體的一種生理防御機制，對于機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用，過高或過低的凋亡都會對機體產(chǎn)生不利影響［12］。心肌是高耗能組織之一。正常心肌主要以產(chǎn)能高、需氧量大的脂肪酸氧化為主要產(chǎn)能方式，其中主要產(chǎn)能方式是心肌細胞線粒體內(nèi)的β氧化。心力衰竭時，脂肪酸氧化減少并在細胞聚集增多導致脂毒性，心肌細胞凋亡增多，加速心功能惡化。因此，從心肌能量代謝角度防治心力衰竭，延緩心力衰竭進展，可能是一條新思路。

研究發(fā)現(xiàn)，很多與代謝酶相關的基因在心力衰竭發(fā)展過程中具有明顯的表達變化，尤其是與脂肪酸氧化相關酶的基因［13-14］。SCAD是脂酰輔酶A脫氫酶家族成員之一，與脂肪酸β氧化密切相關［7］。我們的前期研究結(jié)果表明，病理性心肌肥大時，SCAD的表達量明顯下降，與胚胎期的表達水平一致，能量代謝發(fā)生了胚胎型轉(zhuǎn)變［11］。病理性心肌肥大最終會失代償導致心力衰竭。而心肌細胞凋亡則是心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)化的重要機制。因此，我們進一步觀察了SCAD在心肌細胞凋亡中的變化。

tBHP是一種脂質(zhì)過氧化物，與H2O2性質(zhì)相似，均可用來誘導構(gòu)建細胞氧化損傷模型，但與H2O2相比具有穩(wěn)定性高，不易降解的優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，在體外，tBHP可誘導多種細胞凋亡，且低濃度時細胞多表現(xiàn)為凋亡，而高濃度多致細胞壞死［15］。本研究中，我們采用不同濃度的tBHP處理心肌細胞6 h且用200 μmol/L tBHP作用不同時間。MTT結(jié)果顯示tBHP可以明顯降低細胞存活率，且具有一定的濃度與時間依賴性。根據(jù)文獻報道，常采用細胞存活率為40%～60%的處理因素來選擇誘導凋亡［16］。因此，本研究選擇200 μmol/L tBHP，刺激6 h作為后續(xù)RNA干擾部分的實驗條件。此外，我們用相同時間和濃度的tBHP處理心肌細胞，隨著濃度的增加和時間的延長，SCAD的mRNA和蛋白表達都有一定程度的下降，以濃度為200 μmol/L作用6 h和8 h時，SCAD的表達下降更為顯著，表明在心肌細胞凋亡發(fā)生的過程中SCAD發(fā)生了明顯的變化，這可能與心肌細胞凋亡途徑中能量代謝的轉(zhuǎn)變有關。

為了進一步明確SCAD與心肌細胞凋亡的關系，我們采用了RNA干擾技術，觀察到siRNA干擾心肌細胞引起SCAD表達下調(diào)的同時，心肌細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，與tBHP誘導心肌細胞凋亡的趨勢一致，SCAD表達下調(diào)直接導致了心肌細胞凋亡的發(fā)生，表明SCAD表達下調(diào)在心肌細胞凋亡過程中具有重要作用。siRNA引起心肌細胞SCAD表達下調(diào)的同時，SCAD活性也明顯下降，心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著增多，SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與tBHP誘導心肌細胞凋亡導致的脂質(zhì)變化一致。這表明SCAD的表達下調(diào)可能導致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力下降，從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加，導致心肌細胞凋亡發(fā)生，這一結(jié)果與能量代謝途徑改變和心肌細胞凋亡有密切關系的文獻報道相一致［3］。

綜上所述，SCAD在心肌細胞凋亡過程中可能發(fā)揮了至關重要的作用，為我們進一步研究SCAD在心肌細胞凋亡中的作用奠定了基礎。然而，SCAD的表達失調(diào)在心肌細胞凋亡中的具體作用機制還有待進一步研究。

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(責任編輯:陳妙玲，羅森)

Effects of short-chain acyl-CoA dehydrogenase on cardiomyocyte apoptosis

ZENG Zhen-hua1，HUANG Qiu-ju1，HUANG Jin-xian1，SHU Zhao-hui1，LIU Pei-qing2，CHEN Shao-rui2，LIU Bing1，ZHOU Si-gui1
(1Department of Clinical Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，2Department of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China.E-mail: zhousg201014@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the change of short-chain acyl-CoA dehydrogenase (SCAD) expression during cardiomyocyte apoptosis and to explore the relationship between SCAD and cardiomyocyte apoptosis.METHODS: The neonatal rat cardiomyocytes treated by tert-butyl hydroperoxide (tBHP) were used as the model of cardiomyocyte apoptosis.The cell viability，the expression of SCAD at mRNA and protein levels，the activity of SCAD and the content of free fatty acids were determined.RESULTS: The mRNA and protein expression of SCAD decreased in the cardiomyocyte apoptosis model.Compared with negative control group，SCAD expression and activity were both significantly decreased in siRNA-1186 group，but the content of free fatty acids were obviously increased in the cardiomyocytes.Meanwhile，SCAD siRNA treatment triggered the same apoptosis as cardiomyocytes treated with tBHP.CONCLUSION: Down-regulation of SCAD may play an important role in primary cardiomyocyte apoptosis.Increase in the expression of SCAD may become an important part in intervening cardiomyocyte apoptosis.

［KEY WORDS］Short-chain acyl-CoA dehydrogenase; Cardiomyocytes; Apoptosis; Heart failure; Energy metabolism; Tert-butyl hydroperoxide

通訊作者△Tel: 020-39352123; E-mail: zhousg201014@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No.81000072) ;廣東省“十二五”醫(yī)學重點學科，依托廣東藥學院附屬第一醫(yī)院、藥科學院;廣東省科技計劃(No.2014A020212315)

［收稿日期］2015-04-09

［文章編號］1000-4718(2015)09-1589-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.010