陳樹杰

基礎研究

辛伐他汀后適應對血脂正常大鼠缺血再灌注心肌保護作用

陳樹杰

作者單位：056000 河北省邯鄲市，邯鄲市中心醫(yī)院心內(nèi)科

目的 探討辛伐他汀藥物后適應對缺血再灌注損傷大鼠髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）的影響及減少心肌損害的可能機制。方法 將30只SD大鼠隨機分為假手術組（SH）、缺血/再灌注組（I/R組）和辛伐他汀后適應組（SIM組)，每組10只。通過結扎大鼠冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型。再灌注前，SH組、I/R組經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水1 ml；SIM組經(jīng)頸靜脈注射辛伐他汀（1 mg/100 g）。再灌注2 h后抽靜脈血測定CK-MB、MPO、MDA，測量心肌梗死面積。結果 ①各組大鼠血脂均在正常值范圍內(nèi)；②與SH組比較，I/R組、SIM組CK-MB、MPO、MDA均增高（P＜0.05）；與 I/R組比較，SIM 組 CK-MB[（798.46±105.25）ng/ml比（1572.18±126.32）ng/ml]、MPO[（12.16±2.69）U/L 比（15.32±3.35）U/L]、MDA[（2.15±0.22）nmol/mg prot比（2.78±0.24）nmol/mg prot]下降（P＜0.05）；③與 SH 組比較，I/R 組、SIM 組心肌梗死明顯（P＜0.05）；SIM 組心肌梗死面積小于 I//R 組[（35.79±4.77）%比（46.61±5.18）%，P＜0.05]。結論 辛伐他汀后適應治療可以減輕大鼠心肌炎癥反應，縮小心肌梗死面積，保護心肌并減輕缺血再灌注損傷。

辛伐他汀； 后適應； 缺血再灌注； 大鼠； 髓過氧化物酶； 丙二醛

心肌缺血后適應是指在心肌缺血后、長時間再灌注之前的一段時間內(nèi)，對缺血心肌進行一次或多次短暫的心肌血流再灌注，以提高缺血心肌對之前缺血的耐受性。已有資料證實缺血后適應可挽救瀕死心肌，減少梗死面積[1,2]。缺血再灌注的心肌損傷部分與中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞的相互作用有關，同時細胞因子起著調(diào)節(jié)和修飾作用?！八幬锖筮m應”指通過藥物的作用激發(fā)機體內(nèi)源性物質(zhì)的釋放以起到心肌保護作用。他汀類藥物對血脂正常大鼠缺血后適應心肌保護作用的研究報道較少。本研究觀察辛伐他汀后適應對血脂正常大鼠心肌損傷的保護效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器、試劑、藥品 7180型全自動生化分析儀（生產(chǎn)商：日本日立集團）；STUDENT LAB BASIC多導電生理儀（美國BIOPAC公司）；ECG-6511型心電圖機（生產(chǎn)商：日本光電公司）；752型分光光度計（生產(chǎn)商：上海光譜儀器有限公司）；LDR4-84C低溫離心機（生產(chǎn)商：北京醫(yī)用離心機廠）；DH750型動物人工呼吸機（生產(chǎn)商：浙江大學醫(yī)學儀器廠）。總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）試劑，均購于南京建成生物工程研究所。辛伐他汀購于中國食品藥品檢定研究院，使用無水乙醇溶解后加入與辛伐他汀等物質(zhì)量的NaOH，50℃水浴2 h，調(diào)節(jié)pH至7.20，過濾除菌，整至4 mg/ml供注射用。

1.2 實驗動物 健康清潔Ⅱ級SD大鼠30只，雄性，體重200～250 g。大鼠顆粒全價飼料飲食，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供（實驗動物合格證號：911102）。

1.3 模型分組、給藥 采用隨機數(shù)字表法將實驗用30只SD大鼠隨機分為3組：假手術組（SH）、缺血/再灌注組（I/R組）和辛伐他汀后適應組（SIM組），每組10只。大鼠給藥：SH組、I/R組再灌注前經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水1 ml；SIM組再灌注前給予辛伐他?。? mg/100 g）加生理鹽水至1 ml后經(jīng)頸靜脈注射。

1.4 模型制備、評價 模型制備：1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)注射；連接心電圖；行氣管切開連接小動物呼吸機，設定參數(shù)為頻率70次/min、潮氣量 2 ml/100 g、呼吸比 2∶1、呼氣末壓力 10 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），依據(jù)大鼠呼吸情況調(diào)整參數(shù)。取左側(cè)3～4肋間入路，于左心耳與肺動脈圓錐間穿6/0號絲線，硅膠管套扎前降支阻斷血流，阻斷前降支血流30 min后開通血管再灌注2 h制作I/R模型。SIM組大鼠阻斷血流30 min后經(jīng)頸靜脈給予辛伐他汀進行藥物后適應，開通血管再灌注2 h制模。假手術組在相同位置穿線打一松結。整個動物實驗過程中操作及處理符合動物倫理學標準。

模型評價：結扎前降支30 min后，肉眼觀察見結扎點遠端心肌顏色呈發(fā)紺或藍紫色，心肌收縮力明顯減弱；心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高0.2 mV以上，QRS波群明顯增寬，證實血管閉塞有效。再灌注后上述表現(xiàn)減輕，表示存在心肌再灌注。其中SH組、I/R組、SIM組各死亡2只、3只、2只大鼠，各組以剩余大鼠為實驗對象。

1.5 實驗指標檢測 實驗結束時所有入組大鼠開腹從下腔靜脈取血約4 ml，加入促凝管，室溫靜置1 h，3000 r/min離心5 min，進行編碼后放－20℃冰箱中保存。CK-MB、TC、TG測定：應用7180型全自動生化分析儀（日本日立公司）測定。MPO、MDA含量測定：詳細操作參照試劑盒說明書進行。

1.6 梗死面積測定[3]抽血后開胸切取心臟，冰凍10 min后沿心臟底部橫向切成1～2 mm厚的切片，置入37℃、濃度為1%的氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中20 min，再置入10%甲醛溶液中固定，24 h后計算心肌梗死面積。梗死心肌不著色呈白色，同一標本、同一測量者每次測量3遍，取平均值。計算公式：梗死面積=梗死區(qū)心肌面積（IS）/心肌片總面積（LVS）×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件處理。計量資料以±s表示，組間比較應用單因素方差分析和最小顯著差異LSD法。假設檢驗采用雙側(cè)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血脂情況 SH組、I/R組、SIM組大鼠術后測定 TC 分別為（1.54±0.32）mmol/L、（1.60±0.33）mmol/L、（1.58±0.37）mmol/L，與大鼠 TC 正常值比較未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。SH組、I/R組、SIM組大鼠術后測定TG分別為（0.71±0.28）mmol/L、（0.74±0.32）mmol/L、（0.70±0.31）mmol/L，與大鼠TG正常值比較未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠CK-MB、MPO、MDA比較 各組大鼠的CK-MB、MPO、MDA 有顯著差異（P＜0.05）。與SH 組比較，I/R 組、SIM 組 CK-MB、MPO、MDA 均增高（P＜0.05）；與 I/R組比較，SIM 組 CK-MB、MPO、MDA 下降（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠相關指標比較（±s）

表1 各組大鼠相關指標比較（±s）

注：SH組：假手術組；I/R組：缺血/再灌注組；SIM組：辛伐他汀后適應組；CK-MB：肌酸激酶同工酶；MPO：髓過氧化物酶；MDA：丙二醛；IS/LVS（%）：梗死區(qū)心肌面積（IS）/心肌片總面積（LVS）×100%。與SH組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05

IS/LVS（%）SH 組 8 417.62±91.44 8.44±2.17 1.61±0.08 0 I/R 組 7 1572.18±126.32a 15.32±3.35a 2.78±0.24a 46.61±5.18 SIM 組 8 798.46±105.25ab12.16±2.69ab 2.15±0.22ab 35.79±4.77b組別 例數(shù) CK-MB（ng/ml）MPO（U/L）MDA（nmol/mg prot）

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較 SH組無心肌梗死；SIM組心肌梗死面積小于I/R組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

2002年，華裔學者趙志清和美國學者Vinten Johansen將預處理的實驗方法用于急性缺血發(fā)生后，首次提出缺血后適應（Postconditioning）的概念。與缺血預適應相比，缺血后適應具有更好的可預測性和臨床可控性[4]。缺血后適應對缺血再灌注損傷心肌具有保護作用[5]，“藥物后適應”越來越多的為研究者重視。目前缺血后適應對心臟的保護機制尚未完全闡明：減少氧自由基的產(chǎn)生、抑制線粒體鈣超載、開放線粒體膜ATP敏感性鉀通道、減弱各種炎癥反應、改善血管內(nèi)皮功能等機制均被不同學者提出。

心肌缺血再灌注損傷的主要機制是活性氧簇（ROS）及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應。ROS增加使膜受體、膜蛋白酶和離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境改變，增加胞質(zhì)溶膠鈣，游離鈣離子濃度減少，引發(fā)心律失常和心肌頓抑。MDA是膜脂過氧化反應的最終產(chǎn)物，是目前公認的能較好地反映ROS產(chǎn)生的間接指標。MPO是一種重要的溶體酶，存在于中性粒細胞胞漿的嗜天青顆粒中，既能間接定量反映心肌浸潤中性粒細胞的數(shù)量，又能反映中性粒細胞激活程度。因此心肌組織中MDA、MPO含量的變化可反映心肌組織損傷的嚴重程度。

他汀類藥物不僅能降低血清低密度脂蛋白，還具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用[6-8]。他汀類藥物通過抑制白細胞和內(nèi)皮細胞間的相互作用，減少白細胞的滲出，減輕氧化應激反應，抑制炎癥介質(zhì)的釋放[9]，降低引起組織損傷物質(zhì)的化學活性。雖然已有大量研究[10,11]報道證實他汀類藥物在缺血預適應中的作用，但關于他汀類藥物在血脂正常大鼠心肌缺血后適應中對心肌保護作用的研究少見報道。

本研究顯示，對于血脂正常大鼠，缺血再灌注組、辛伐他汀后適應組大鼠CK-MB、MPO、MDA、心肌梗死面積均高于模型組，證實制模成功。給予辛伐他汀進行藥物后適應治療顯示，大鼠CK-MB、MPO、MDA、心肌梗死面積較缺血再灌注組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明辛伐他汀可以起到保護心肌作用以減小心肌梗死面積，可能機制是通過減少活性氧簇、抑制炎癥反應、減少氧自由基、保護膜穩(wěn)定性等作用，起到心肌及心血管保護作用。本研究應用辛伐他汀使用無水乙醇溶解后加入等物質(zhì)量的NaOH溶解，于前降支血流阻斷30 min后經(jīng)頸靜脈給藥后再灌注2 h，以發(fā)揮辛伐他汀的心肌保護作用[12]。

綜上所述，經(jīng)過辛伐他汀后適應治療的血脂正常大鼠心肌損傷明顯減輕，證實辛伐他汀能夠通過抑制氧自由基活性及炎癥應激反應等途徑起到心肌保護作用。但辛伐他汀在藥物后適應治療過程中具體機制仍需進一步研究探討。

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Effects of postconditioning with Simvastatin in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol

Effects of postconditioning with Simvastatin in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol

CHEN Shu-jie.Department of Cardiology，Handan Center Hospital，Handan 056000，China

ObjectiveTo test the effects of postconditioning with Simvastatin on MPO and MDA in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol.Methods30 SD rats were randomly divided into there groups：Sham operation group（SH），Ischemia-reperfusion injury model group（I/R），Simvastatin postconditioning group（SIM）.The ischemia-reperfusion injury models of rats were established by left anterior decending branch of coronary artery ligature.SH，I/R group：1 ml normal saline was injected through the internal jugular vein before reperfusion.SIM group：Simvastatin 1 mg/100 g dissolve to 1 ml normal saline was injected through the internal jugular vein before reperfusion.After two hour reperfusion，rats were executed，plasma CK-MB，MPO，MDA and myocardial infarct size were detected.Results⑴The plasma cholesterol concentration of there groups rats was measured in normal range.⑵The study shows the CK-MB，MPO and MDA of I/R，SIM group were significantly increased compare with SH group（P＜0.05）.The CK-MB，MPO and MDA of SIM group was significantly decreased compare with I/R group，CK-MB[（798.46±105.25）ng/ml vs（1572.18±126.32）ng/ml]，MPO[（12.16±2.69）U/L vs（15.32±3.35）U/L]and MDA[（2.15±0.22）nmol/mg prot vs（2.78±0.24）nmol/mg prot]（P＜0.05）.⑶The myocardial infarct size of I/R，SIM groups were significantly increased compare with SH group[（35.79±4.77）%vs（46.61±5.18）%，P＜0.05].These of SIM group was significantly decreased compare with I/R group.ConclusionSimvastatin postconditioning can relieve inflammatory response，reduce myocardial infarction area，protect myocardial cells，and attenute myocardial ischemia-reperfusion injury.

Simvastatin； Postconditioning； I/R； Rats； MPO； MDA

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．04．021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）04-0372－04

2015-01-04）