徐輝　陳虹霞　鄒先彪（．解放軍醫(yī)學(xué)院，北京00853；．解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，北京00048）

不同濃度5?氨基酮戊酸對光動力方法抗白念珠菌效果的影響

徐輝1陳虹霞2鄒先彪2
（1．解放軍醫(yī)學(xué)院，北京100853；2．解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，北京100048）

目的通過測定白念珠菌內(nèi)不同光敏劑濃度下生成原卟啉IX（PpIX）的水平及5?氨基酮戊酸光動力療法（5?ALA?PDT）對白念珠菌的抑菌率，為臨床選擇最佳光敏劑濃度提供理論依據(jù)。方法制備白念珠菌懸液，與ALA避光孵育，采用激光共聚焦顯微鏡觀察PpIX產(chǎn)生情況，MTT法測定5?ALA?PDT對白念珠菌生長的抑制率。結(jié)果白念珠菌與ALA避光孵育后有熒光物質(zhì)PpIX產(chǎn)生，ALA光敏劑濃度與PpIX強度呈正相關(guān)，當(dāng)ALA濃度到達300 mg／mL時，PpIX強度將不再增加。對照組無熒光物質(zhì)出現(xiàn)。結(jié)論ALA?PDT對白念珠菌抑制效應(yīng)同光敏劑濃度密切相關(guān)。這為臨床ALA?PDT治療白念珠菌疾病提供了理論依據(jù)。

5?氨基酮戊酸；光動力；白念珠菌；藥物濃度

［Chin J Mycol，2015，10（2）：104?107］

念珠菌作為人體常見的條件致病菌，常引起局部及全身系統(tǒng)的感染，近年來隨唑類抗真菌藥的廣泛應(yīng)用，其耐藥性不斷增強，這使得人們不斷尋求新的治療手段和方案。5?ALA?PDT是近年來興起的一種治療皮膚病的光化學(xué)技術(shù)，被證明可以殺死細菌、酵母和絲狀真菌等微生物［1］。在抑制芽管和生物膜形成、降低念珠菌對口腔上皮細胞黏附性方面效果明顯［2］。由于各國的研究者所使用的ALA的濃度、激光光源、孵育時間、總能量都有所不同，導(dǎo)致對ALA?PDT的療效評價缺乏一致性［3］。本研究通過測定白念珠菌與5?ALA不同濃度下生成PpIX的水平及5?ALA?PDT抑菌率，探求PpIX峰值出現(xiàn)的規(guī)律，為5?ALA?PDT治療局部念珠菌感染選擇最佳光敏劑濃度提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1　材料和方法

1．1菌株與試劑

試驗用白念珠菌標準菌株5株（編號sc5314）取自304醫(yī)院皮膚科實驗室。5?ALA：由上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司提供，臨用前以生理鹽水配制成ALA溶液。PBS緩沖液、HyClone改良型RPMI1640液體培養(yǎng)基、沙堡氏培養(yǎng)基由Gibico公司提供。MTT購自武漢亦新生物技術(shù)有限責(zé)任公司。二甲基亞砜（DMSO）購自西隴化工股份有限公司。

1．2主要儀器

LD600?A型半導(dǎo)體激光治療機，波長為635 nm，最大輸出功率密度為100 mw／cm2，由武漢亞格光電技術(shù)有限公司提供。RT?3000全自動洗板機，DNM?9602酶標分析儀（由北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)），空氣浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造）；TCSSPII型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司產(chǎn)品）；倒置顯微鏡（奧林帕斯，日本）。

1．3方法

白念珠菌懸液的制備將白念珠菌在新鮮配制的沙堡氏培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種兩次，35℃培養(yǎng)24 h后，取生長良好的菌落5個加入放有50mL YPD液體培養(yǎng)基的150mL錐形瓶中，置于37℃恒溫搖床搖動培養(yǎng)（100 r／min）24 h獲得菌液，用1640培養(yǎng)液稀釋。通過血細胞計數(shù)板調(diào)整含菌量，使菌懸液含菌量為1×106CFU／mL。接種時加人96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL。

白念珠菌的分組試驗組：6組，分別加入終濃度為50 mg／mL（5%）、100 mg／mL（10%）、200 mg／mL（20%）、300 mg／mL（30%）、400 mg／mL（40%）、500 mg／mL（50%）ALA溶液，避光35℃孵育60min，每組6個培養(yǎng)孔，3個用于測定PpIX，以平均值計算胞內(nèi)PpⅨ水平；3個用于測定光動力處理后的MTT測定。設(shè)3個對照組：a：白念珠菌菌懸液組，不進行光動力處理；b：菌懸液加不同濃度ALA不進行照光組；c：菌懸液不加ALA只進行光照處理組。對照組35℃孵育60min。

半導(dǎo)體激光照射激光頭與培養(yǎng)板的垂直距離為2 cm，剛好能覆蓋培養(yǎng)孔上口，照射的能量密度為27 J／cm2。照光時間3min。

激光共聚焦顯微鏡觀察PpIX熒光產(chǎn)生情況

將不同濃度的混懸培養(yǎng)物滴加在準備好的干凈的載玻片，蓋上蓋玻片，吸水紙吸除周邊液體，直接放置在激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，用隨機自帶軟件進行熒光強度定量分析。

菌落計數(shù)光照后，立即將各組菌懸液用PBS進行倍比稀釋，使菌懸液含菌量為1×104CFU／mL，分別取樣100μL轉(zhuǎn)到另一張無菌培養(yǎng)板上，35℃避光培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

MTT法測定不同光敏劑濃度下ALA?PDT對白念珠菌活力的抑制率光動力處理結(jié)束后，每孔加入20μL MTT（5 mg／mL），100μL PBS培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL DMSO，37℃溫箱孵育10min。之后用酶標儀檢測OD 490 nm各孔的吸光度（A）值。計算白念珠菌細胞活力＝（試驗組A值?調(diào)零孔A值）／（對照孔A值?調(diào)零孔A值）×100%，從而得出抑制率。

1．4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)　果

2．1定量分析

表1　不同濃度5?ALA與白念珠菌避光35℃共孵育60min后PpIX熒光強度Tab．1　PpIX fluorescent intensity after C．a(chǎn)lbicans incubated with dif?ferent concentration of ALA

固定孵育時間和照光劑量，對照組沒有產(chǎn)生熒光強度，試驗組隨ALA濃度的升高PpIX生成也增強（見表1）。通過spss統(tǒng)計軟件分析F值43．868，P＜0．05，各實驗組兩兩分析：200 mg／mL、300 mg／mL、400 mg／mL、500 mg／mL ALA溶液與白念珠菌避光孵育產(chǎn)生的PpIX熒光強度之間無差異，與50 mg／mL及100 mg／mL濃度相比差異顯著。從經(jīng)濟效益角度來看，選擇200 mg／mL ALA濃度最為經(jīng)濟有效。

2．2倒置顯微鏡觀察

不同濃度ALA?PDT處理后倒置顯微鏡所見，見圖1。

圖1　a、b、c、d、e、f分別為50 mg／mL、100 mg／mL、200 mg／mL、300 mg／mL、400 mg／mL、500 mg／mL濃度ALA?PDT處理后倒置顯微鏡下圖片F(xiàn)ig．1　Inverted microscope image after 5?ALA?PDT solution with differ?ent concentration of ALA：a．50 mg／mL，b．100 mg／mL，c．200 mg／mL，d．300 mg／mL，e．400 mg／mL，f．500 mg／mL

隨濃度升高，首先菌絲和孢子都在不斷減少，200 mg／mLALA濃度光動力處理后菌絲和孢子均消失。300 mg／mL ALA濃度以上的光動力處理后既看不到菌絲和孢子，生物膜結(jié)構(gòu)也開始變得松散無章（圖片黑色影為生物膜結(jié)構(gòu)）。

2．3MTT法測定ALA?PDT對白念珠菌活力的抑制率

隨ALA濃度的升高，抑制率增加，濃度大于300 mg／mL時，白念珠菌幾乎達到完全抑制（見表2）。統(tǒng)計分析F值為2 017．9，200 mg／mL以上各濃度組與50 mg／mL、100 mg／mL兩兩比較P＜0．05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。意味著從200 mg／mL開始白念珠菌開始被顯著抑制。超過300 mg／mL，白念珠菌幾乎完全抑制。200 mg／mL以上各組之間P＞0．05無統(tǒng)計學(xué)差異。

2．4菌落計數(shù)

隨ALA濃度增加，白念珠菌菌落數(shù)不斷減少，超過300 mg／mL，菌落數(shù)均為0（見表3）。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)F值為2 034．34，兩兩分析顯示，對照組各組間P＞0．05，無統(tǒng)計學(xué)意義；對照組分別與50 mg／mL組、100 mg／mL組比較P＜0．05，有統(tǒng)計學(xué)差異。對照組與200 mg／mL組比較P＜0．01，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。200 mg／mL以上濃度各組間P＞0．05無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2　MTT法測定不同ALA濃度下ALA?PDT抑制率Tab．2　Used by MTT method to determine the inhibition rate of Candi?da albicans after 5?ALA?PDT solution with different concentration of ALA

表3　不同ALA濃度PDT處理后菌落計數(shù)Tab．3　The colony count of Candida albicans after 5?ALA?PDT solu?tion with different concentration of ALA（Mean±SD）

3　討　論

隨著激素、廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，真菌感染的發(fā)病率不斷上升，真菌耐藥性日趨嚴重，使得抗真菌藥物治療面臨的挑戰(zhàn)越來越大。5?ALA?PDT是一種聯(lián)合應(yīng)用5?ALA及相應(yīng)光源，通過光動力學(xué)反應(yīng)生成具有殺傷細胞作用的單態(tài)氧，選擇性破壞病變組織的全新技術(shù)。廣泛用于治療光化性角化病、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、鮑恩病等皮膚癌前病變和腫瘤［4?6］，其應(yīng)用前景值得期待［7?10］。5?ALA作為一種內(nèi)源性的生化物質(zhì)經(jīng)局部酶反應(yīng)后，最終轉(zhuǎn)化為PpIX。光動力抗菌化學(xué)療法的療效取決于真菌體內(nèi)PpIX的生成水平，而PpIX在真菌體內(nèi)的合成受游離血紅素濃度的反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)外源性ALA過量時，在真菌細胞會產(chǎn)生過量的PpIX，如不發(fā)生光動力學(xué)反應(yīng)，PpIX將在體內(nèi)亞鐵螯合酶催化下與鐵離子結(jié)合生成血紅素［11］，從而使PpIX水平下降。本次試驗結(jié)果顯示，隨ALA濃度增加，白念珠菌體內(nèi)的PpIX也在不斷增加，在50～300 mg／mL濃度下白念珠菌的抑制率與濃度呈正相關(guān)，到300 mg／mL以上白念珠菌完全抑制。這一結(jié)果與梁義［12］所做試驗相吻合。白念珠菌具有孢子相和菌絲相，苑天紅等［13］推測，有效阻止孢子相向菌絲相轉(zhuǎn)變，即可降低白念珠菌對口腔頰黏膜細胞的黏附，進而降低白念珠菌的毒力。從倒置顯微鏡圖片可以看出光動力療法不光針對白念珠菌的孢子相起作用，對菌絲相同樣起到殺傷作用。隨ALA濃度增加，白念珠菌菌落數(shù)不斷減少，200 mg／mL以上各組之間統(tǒng)計學(xué)無意義，但與對照組及低濃度組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異。說明200 mg／mL濃度開始，對白念珠菌的抑制作用比較顯著。超過300 mg／mL，菌落數(shù)均為0。

MTT是測定真核細胞活性的重要工具。其原理是活細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶還原與MTT結(jié)合，生成藍紫色結(jié)晶可在酶標儀上讀取吸光度值，并以此反映細胞的代謝活性。Levitz等［14］最早使用MTT方法測定真菌細胞的活力，本實驗中通過測定吸光度值計算出光動力治療對白念珠菌生長的抑制率。隨ALA濃度的升高，抑制率增加，從200 mg／mL開始白念珠菌開始被顯著抑制，濃度大于300 mg／mL時，白念珠菌幾乎達到完全抑制。對照組各組白念珠菌幾乎無抑制。

4　結(jié)　論

本研究采用通過測定白念珠菌內(nèi)不同光敏劑濃度下生成原卟啉IX（PpIX）的水平，在此基礎(chǔ)上進行了5?ALA?PDT抑菌抑菌效果的試驗。本實驗從原卟啉IX的產(chǎn)生強度、白念珠菌抑制率、剩余菌落計數(shù)幾個方面觀察了各濃度ALA光動力法對白念珠菌的抑制作用，從實驗結(jié)果看200mg／mL以上濃度各組白念珠菌開始被顯著抑制，考慮經(jīng)濟成本因素，認為200 mg／mL ALA濃度是光動力法抑制白念珠菌的最佳濃度。由于體外培養(yǎng)條件下白念珠菌增殖與體內(nèi)實際感染情況存在差別，因此，今后我們將采用動物實驗進一步研究ALA?PDT抗菌效應(yīng)，為臨床治療局部真菌感染提供更完善的理論依據(jù)。

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［本文編輯］衛(wèi)鳳蓮

The antifungal effect of 5?aminolevulinic acid photodynamic therapyat different concentrations on C．a(chǎn)lbicans

XU Hui1，CHEN Hong?xia2，ZOU Xian?biao2
（1．Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China；2．Department of Dernatlogy，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijng 100048，China）

ObjectiveTo contribute theoretically to the selection of the optimal concentration of the photosensitizer through the determination of the level at which C．a(chǎn)lbicans generate protoporphyrin IX（PpIX）under different concentrations of the photosensitizer and of the bacteriostatic rate of 5?amino ketones pentanoic acid photodynamic therapy（5?ALA PDT）．MethodsC．a(chǎn)lbicans suspen?sion was prepared and incubated with ALA in the dark．The generation of PpIX was observed under a laser confocal microscope．The inhibitory rate of 5?ALA PDT on C．a(chǎn)lbicans was determined by MTT method．ResultsAfter dark incubation，C．a(chǎn)lbicans and ALA produced fluorescent PpIX．ALA concentration was positively correlated with the intensity of PpIX．When drug concentration reached300mmol／L，the intensity of PpIX strength ceased to increase．There was no fluorescent material in control group．Conclusions The inhibitory effect of ALA PDT on C．a(chǎn)lbicans was closely related to the concentration of the photosensitizer，which provides data for treatment of C．a(chǎn)lbicans infection．

5?amino ketones pentanoic acid；photodynamic；C．a(chǎn)lbicans；drug concentration

R 379．4

A

1673?3827（2015）10?0104?04

徐輝，男（漢族），碩士研究生在讀，主治醫(yī)師．E?mail：81764988＠qq．com

鄒先彪，E?mail：xbzou＠126．com

2014?12?30