張?jiān)溃w巖*，蔡恩博，劉雙利，楊鶴，張連學(xué)*，王士杰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 中藥學(xué)院，吉林 132101)

·中藥工業(yè)·

響應(yīng)面法優(yōu)化草本水楊梅多酚超聲輔助提取工藝及抗氧化活性△

張?jiān)?，趙巖1*，蔡恩博1，劉雙利1，楊鶴1，張連學(xué)1*，王士杰2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 中藥學(xué)院，吉林 132101)

目的：優(yōu)化草本水楊梅多酚的超聲提取工藝，并研究其抗氧化活性。方法：以草本水楊梅為原料，采用超聲輔助法提取草本水楊梅多酚，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素五水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù)。結(jié)果：草本水楊梅最佳提取工藝條件為乙醇濃度33.76%，超聲提取時(shí)間36.94 min，液固比為201.78 mL·g-1，在此條件下草本水楊梅多酚提取率為9.67%；三因素對(duì)草本水楊梅多酚提取率影響主次順序?yàn)橐掖紳舛?超聲提取時(shí)間>液固比。并以水溶性VC和BHT為對(duì)照物，通過DPPH自由基清除法和總還原力法對(duì)草本水楊梅多酚的抗氧化活性進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)草本水楊梅多酚的清除DPPH自由基能力和總還原能力均隨多酚濃度的增加而上升。結(jié)論：由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的草本水楊梅多酚的提取工藝方便可行，得到的草本水楊梅多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，為草本水楊梅資源的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

草本水楊梅；多酚；超聲波輔助提??；響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)；抗氧化性

草本水楊梅別名追風(fēng)七、老五葉、海棠菜，為薔薇科水楊梅屬植物[1]，主要分布于我國東北、華北、西北等地區(qū)[2]，長白山海拔400～1500 m山區(qū)分布尤為豐富[3]。民間以其全草或根入藥[4]，具有清熱解毒、消腫止痛、利尿等功能[5]，臨床主要用于治療腸炎、腰腿疼痛、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、疥瘡、癰腫等癥[6]。近年大量研究表明，合成抗氧化劑BHA/BHT具致癌作用，而天然抗氧化劑不僅能抗衰老、抗輻射、捕集體內(nèi)自由基的抗氧化等功能[7-8]，且抗氧化效率高、作用時(shí)間長、熱穩(wěn)定性好、清除氧自由基能力強(qiáng)、毒副作用小[9-13]。多酚類物質(zhì)作為新型天然高效抗氧化劑，也越來越受關(guān)注[14]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，草本水楊梅中含有多酚類物質(zhì)[15-17]，而對(duì)其多酚的提取工藝沒有研究，抗氧化活性方面也鮮有報(bào)道。筆者建立了草本水楊梅多酚提取數(shù)學(xué)模型，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行初步研究，以期為草本水楊梅多酚作為天然抗氧化劑的資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草本水楊梅采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)水洗、陰干、粉碎，備用；沒食子酸(北京百靈威科技有限公司)；福林酚試劑(合肥博美生物)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、維生素C(Vc)(上海源葉生物科技有限公司)；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(百靈威科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CGT-3.5K超聲波清洗器(港威超聲電子有限公司)；LD-34流水式中藥粉碎機(jī)(大海藥材器械廠)；百靈LA114型電子天平(百靈天平儀器有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；HH-W-600型數(shù)顯恒溫水箱(金壇市江南儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 草本水楊梅多酚類物質(zhì)的超聲輔助提取 精確稱取0.10 g草本水楊梅原料粉，放入三角瓶中，加入一定量的提取溶劑，超聲波提取多酚類物質(zhì)，抽濾后密封避光儲(chǔ)存，待測(cè)。

1.3.2 多酚的測(cè)定 采用福林酚比色法測(cè)定[18]，移取0.5 mL樣品溶液放入25 mL容量瓶中，加入2.5 mL福林酚試劑和2 mL質(zhì)量濃度為75 g·L-1的碳酸鈉(Na2CO3)溶液，50 ℃水浴加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容，760 nm波長處測(cè)吸光度，以蒸餾水為空白對(duì)照，沒食子酸為對(duì)照品，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算多酚含量。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 精密度試驗(yàn) 重復(fù)測(cè)定同一草本水楊梅供試品顯色后溶液6次，測(cè)吸光度并計(jì)算RSD。

1.3.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在0、0.5、1、1.5、2 h測(cè)定同一草本水楊梅供試品溶液顯色中的多酚含量，計(jì)算得其RSD。

1.3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末，按1.3.1項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，顯色后測(cè)定多酚含量并計(jì)算其RSD。

1.3.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一已知多酚含量的草本水楊梅藥材粉末6份，精密稱定，分別加入適量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.1項(xiàng)下方法制成供試品溶液，顯色后測(cè)定其多酚含量，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.3.4 草本水楊梅多酚提取的單因素試驗(yàn) 分別以乙醇濃度、超聲時(shí)間、液固比3個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，優(yōu)化草本水楊梅多酚的提取工藝。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 吸取不同梯度樣品溶液3 mL與3 mL DPPH(質(zhì)量濃度為0.04 mg·mL-1)溶液混合，室溫避光靜置30 min后測(cè)定515 nm處吸光度(A1)。同時(shí)測(cè)定3 mL乙醇與3 mLDPPH(A2)、3 mL樣品溶液與3 mL乙醇(A3)的515 nm處吸光度，按如下公式計(jì)算DPPH清除率：SA%=(A2-A1+A3)/A×100%[19-21]。

1.3.6.2 還原能力測(cè)定(鐵氰化鉀法)分別取不同梯度樣品溶液2.5 mL，加入濃度為0.2 mol·mL-1的磷酸鹽(pH=6.6)緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2.5 mL，混合均勻，于50 ℃反應(yīng)20 min，放涼，再加入2.5 mL10%三氯乙酸。從上述混合液中取出2.5 mL放入新的刻度試管中，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%氯化鐵(FeCl3)溶液，以甲醇為空白對(duì)照，BHT、VC為對(duì)照品，在700 nm波長處測(cè)定吸光值。鐵離子還原法測(cè)定的吸光度值越高，則代表該化合物還原力越強(qiáng)[22-23]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用SAS Server 7.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)模型，用嶺脊分析優(yōu)化試驗(yàn)工藝，并采用Origin V8.0軟件進(jìn)行直觀作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的確定 在超聲時(shí)間為30 min、液固比為200 mL·g-1的條件下，分別采用體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液提取草本水楊梅多酚，乙醇濃度和多酚提取率的關(guān)系見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

由圖1可知，隨乙醇濃度增加，提取率呈現(xiàn)出先增加后逐漸降低的趨勢(shì)，其中以60%乙醇溶液提取效果最好。由于多酚是一大類極性范圍很廣的物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)提取溶劑的極性與多酚的極性接近時(shí)，多酚的提取效果會(huì)更好，所以適當(dāng)?shù)囊掖紳舛扔欣诖既苄院退苄远喾拥娜艹鯷24]。考慮到提取成本及操作方便性，可將乙醇濃度考察范圍定為0～60%。

2.1.2 超聲時(shí)間的確定 在液固比200 mL·g-1、乙醇濃度為60%的條件下，分別超聲提取5、10、20、30、40、50 min，超聲時(shí)間和多酚提取率的關(guān)系見圖2。

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

由圖2可知，整體趨勢(shì)上，隨著超聲提取時(shí)間的延長，草本水楊梅中多酚的溶出量逐漸增大。10～20 min，提取率增長緩慢；20～40 min，提取率增加較快；40～50 min，提取率增加平緩。考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的耗能和效率問題，提取時(shí)間過長會(huì)使生產(chǎn)周期延長，提高生產(chǎn)成本，增高能耗[22]，因此超聲提取時(shí)間考察范圍定為20～50 min。

2.1.3 液固比的確定 分別以液固比20、50、100、150、200、250、300 mL·g-1，60%乙醇溶液對(duì)草本水楊梅超聲提取50 min，液固比和多酚提取率的關(guān)系見圖3。

圖3 液固比對(duì)多酚提取率的影響

由圖3可知，隨液固比增大，草本水楊梅中多酚提取率逐漸增大。液固比20～150 mL·g-1，提取率增加幅度較大；液固比150～300 mL·g-1，提取率增加緩慢?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中溶劑回收問題，應(yīng)盡可能選擇較小的液固比，液固比的考察范圍定為100～250 mL·g-1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 由精密度試驗(yàn)結(jié)果得吸光度平均值為0.402，吸光度RSD值為0.87%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 由穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果得多酚含量平均值為4.97%，多酚含量RSD值為2.16%(n=5)，表明穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 由重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果得多酚含量平均值為4.91%，多酚含量RSD值為2.44%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 由加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果得平均回收率為99.96%，RSD值為1.75%(n=6)，表明回收率較好，方法穩(wěn)定、可靠，可用于草本水楊梅多酚的含量測(cè)定。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以草本水楊梅多酚提取率(Y)為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取條件。以影響多酚提取率的3個(gè)因素：乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液固比(C)為自變量，采用三因素五水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2，其中1～12組為析因試驗(yàn)，13～17組為中心試驗(yàn)，用來分析試驗(yàn)誤差。

表1 草本水楊梅多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平

表2 草本水楊梅多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)

2.3.2 響應(yīng)面分析 利用SAS Server7.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸模型參數(shù)估計(jì)值，見表3，方差分析表見表4，脊嶺分析表見表5。

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

注：**影響極顯著，P<0.01；*影響顯著，P<0.0 5；N影響不顯著，P>0.05。下同。

由表3可得，草本水楊梅多酚的提取量對(duì)所選3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型Y=-1.954309+0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2-0.001812AB-0.003442B2+0.000323AC+0.000366BC-0.000162C2。在一次項(xiàng)的預(yù)測(cè)中，乙醇濃度(A)對(duì)多酚提取率的影響最大(P<0.01)，達(dá)到極顯著水平。超聲提取時(shí)間(B)和液固比(C)對(duì)多酚提取率的影響較大(P<0.05)，達(dá)到顯著水平，三者影響大小順序?yàn)椋阂掖紳舛?A)>超聲提取時(shí)間(B)>液固比(C)；在二次項(xiàng)的預(yù)測(cè)中，A、B和C都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；在交互項(xiàng)中，A乘以B、A乘以C都達(dá)到了顯著水平(P<0.05)；截距和交互項(xiàng)中的B乘以C均影響不顯著(P>0.05)，刪除不顯著項(xiàng)，形成校正的回歸方程：Y=0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2-0.001812AB-0.003442B2+0.000 323AC-0.000162C2，其對(duì)提取率的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值誤差較大。因此，放棄對(duì)回歸方程的校正，在P<0.5水平上接受所有系數(shù)及截距的假設(shè)。最終確定多酚提取率的回歸方程為：Y=-1.954309+0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2- 0.001812AB-0.003442B2+0.000323AC+0.000366BC-0.000162C2。

表4 回歸模型的方差分析

表4回歸方程的方差分析可以看出，總模型、線性項(xiàng)、平方項(xiàng)的P<0.01，表明總模型和方程的線性項(xiàng)、平方項(xiàng)對(duì)多酚提取率的影響極顯著；而方程的交互項(xiàng)的P<0.05，表明其對(duì)提取率的影響顯著。相關(guān)性分析中，總模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.965 1，表明回歸方程對(duì)多酚提取率的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值有較好的相關(guān)性。失擬性檢驗(yàn)分析中，P>0.05，表明失擬性不顯著，該回歸方程無失擬因素存在，回歸方程與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。

表5 模型嶺脊回歸分析

嶺脊分析結(jié)果，見表5，回歸方程預(yù)測(cè)的多酚最佳提取條件：乙醇濃度為33.76%，超聲提取時(shí)間36.94 min，液固比為201.78 mL·g-1。為驗(yàn)證模型的有效性，在上述條件下，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果分別為：9.65%、9.67%、9.52%，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合良好，進(jìn)一步說明模型的可行性。

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、液固比對(duì)提取量的影響。響應(yīng)曲面及其等高線如圖4～6所示。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[17]。圖4～6直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖4 Y=f(B，C)響應(yīng)面圖形(固定A=30)

圖5 Y=f(A，C)響應(yīng)面圖形(固定B=35)

對(duì)圖進(jìn)行分析可得出，乙醇濃度對(duì)多酚提取量影響極為顯著，超聲時(shí)間和液固比對(duì)多酚提取量的影響較為顯著。由圖4的等高線圖可知，超聲提取時(shí)間應(yīng)在30 ～40 min選擇，液固比應(yīng)該在160 ～240 mL·g-1選擇；由圖5的等高線圖可知，乙醇濃度應(yīng)在30%～45%選擇，液固比應(yīng)該在170～230 mL·g-1選擇；由圖6的等高線圖可知，乙醇濃度應(yīng)在25%～50%選擇，液固比應(yīng)該在25 ～45 min選擇。以上響應(yīng)面圖和等高線圖的分析結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了通過嶺脊分析而獲得的最佳工藝參數(shù)。

2.4 草本水楊梅多酚抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 草本水楊梅多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力 由圖7可知，草本水楊梅多酚與Vc和BHT一樣具有較好的清除DPPH自由基的能力。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，其清除能力也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。因此，草本水楊梅多酚提取液具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

圖6 Y=f(A，B)響應(yīng)面圖形(固定C=175)

圖7 草本水楊梅多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4.2 草本水楊梅多酚的還原能力 由圖8可以發(fā)現(xiàn)，草本水楊梅多酚的還原能力低于對(duì)照組Vc和BHT。整體來看，草本水楊梅多酚的還原能力隨提取液質(zhì)量濃度的增加而提高，有較好線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖8 草本水楊梅多酚還原能力測(cè)定

3 結(jié)論

3.1響應(yīng)面分析法得到的超聲波輔助提取草本水楊梅多酚最優(yōu)工藝：乙醇濃度為33.76%，超聲提取時(shí)間為36.94 min，液固比為201.78 mL·g-1，多酚提取量為9.67%。乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、液固比對(duì)草本水楊梅多酚的提取率有顯著影響，影響大小順序?yàn)椋阂掖紳舛?超聲提取時(shí)間>液固比。

3.2通過測(cè)定DPPH自由基清除力和鐵氰化鉀還原法兩種體外抗氧化評(píng)價(jià)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)草本水楊梅多酚具有較強(qiáng)的自由基清除力及還原能力，在一定的濃度范圍內(nèi)，提取液質(zhì)量濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。隨著近幾年對(duì)植物抗氧化成分研究的不斷深入，植物性抗氧化物質(zhì)在醫(yī)藥、食品行業(yè)等領(lǐng)域的使用日益增多。本研究為草本水楊梅資源的開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

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Polyphenols fromGeumaleppicum：OptimizationofUltrasonic-assistedExtractionProcessbyResponseSurfaceMethodologyandAntioxidantActivityEvaluation

ZHANG Yue1，ZHAO Yan1*，CAI Enbo1，LIU Shuangli1，YANG He1，ZHANG Lianxue1*，WANG Shijie2

(1.Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University，Jilin Changchun 130118，China；2.College of Chinese Medicine，Jilin Academy of Agricultural Science and Technology，Jilin 132101，China)

Objective：The optimum conditions of ultrasonic extraction and antioxidant activities ofGeumaleppicum.Polyphenols(GP)were investigated in this paper.Methods：Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of GP.On the basis of one-factor-at-a-time experiments，polyphenols yield was investigated by response surface methodology with respect to ethanol concentration，ultrasonic time and solid-liquid at five levels.Results：The optimum extraction conditions were as follows：ethanol concentration 33.76%，ultrasonic time 36.94 min and solid-liquid 201.78 mL·g-1，and under this conditions，the yield of GP was 9.67%.The primary and secondary order of three factors affecting on extraction rate of GP were ethanol concentration>ultrasonic time>solid-liquid.The antioxidant activityinvitroof the obtained extract was evaluated by DPPH free radical scavenging assay and total reducing power using water-soluble Vc and BHT as the control.DPPH free radical scavenging capacity and reducing power increased with the increasing concentration of GP in a linear dose-dependent manner.Conclusion：Optimization of the extraction process by RSM of GP is convenient and feasible.GP has good antioxidant activity，and this laid the foundation for the development and utilization of resources ofG.aleppicum.

GeumaleppicumJacq.；polyphenols；response surface methodology(RSM)；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.017

2014-06-12)

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI03B01)；國家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303111)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)(20126046, 20140204013YY, YYZX201258)；國家自然科學(xué)基金(31000154)

*

趙巖，副教授，碩士生導(dǎo)師；E-mail：zhyjlu79@163.com； 張連學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師；E-mail：zlx863@163.com