吳迪，鐘珊珊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

·基礎(chǔ)研究·

大黃素抑制軟脂酸誘導(dǎo)的大鼠VSMCs炎性細(xì)胞因子的表達(dá)△

吳迪*，鐘珊珊

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

目的：探討大黃素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α及iNOS的影響。方法：培養(yǎng)鑒定原代大鼠VSMCs，使用不同濃度的大黃素(1、10、50 μmol·L-1)預(yù)孵育VSMCs 24 h，再以濃度為100 μmol·L-1的軟脂酸刺激24 h，使用RT-PCR、western blot分別測(cè)定VSMCs CRP、TNF-α、iNOS 的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：濃度為50 μmol·L-1的大黃素預(yù)孵育大鼠VSMCs 24 h后，與軟脂酸組相比，CRP、TNF-α、iNOS的mRNA及蛋白的表達(dá)顯著性降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：大黃素能濃度依賴性地抑制軟脂酸誘導(dǎo)的大鼠VSMCs 炎性因子的表達(dá)，可以通過抗炎而達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

大黃素；軟脂酸；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞因子；動(dòng)脈粥樣硬化

大黃素(emodin，EMO)屬蒽醌類衍生物，可以通過調(diào)脂、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等途徑，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)功能。EMO可以抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)核抗原蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期的移行，抑制VSMCs的增殖[1]，而達(dá)到抗As的作用。現(xiàn)代研究表明，炎癥反應(yīng)參與了As的發(fā)生和發(fā)展，EMO對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，可以抑制NF-κB的活化，抑制炎癥反應(yīng)中一氧化氮(NO)的大量合成和釋放[2]。但EMO對(duì)VSMCs炎性細(xì)胞因子的研究不多，對(duì)抗炎、抗As的研究也不多，且機(jī)理不明。本研究擬設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，探討EMO對(duì)軟脂酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)的VSMCs炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，研究EMO的抗As作用，深入了解EMO藥理作用，為其臨床使用提供新的思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重100～150 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXX 2012-005。

1.2 藥品及試劑

EMO(陜西中鑫生物技術(shù)有限公司)；PA(美國Sigma公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)；C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(美國Abcam公司)；GAPDH抗體、兔抗大鼠平滑肌α-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠lgG(H+L)、SP-9000免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

2 方法

2.1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)

100～150 g的SD雄性大鼠，麻醉后在無菌條件下迅速開胸，取出大鼠胸主動(dòng)脈段，使用PBS洗滌3次，剝?nèi)ネ饽?，刮去?nèi)膜。將處理好的中膜移入培養(yǎng)皿中，剪成大約1 mm的碎片，將碎片均勻鋪于培養(yǎng)瓶壁上，將瓶翻轉(zhuǎn)，再加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)，2～4 h后將瓶輕輕翻回，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中。待單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，采用酶消化法傳代。實(shí)驗(yàn)中采用3～7代細(xì)胞，細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前，換成含0.4% FBS的DMEM培養(yǎng)基，去血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。

2.2 VSMCs的鑒定

取濃度為1×106/mL第3代VSMCs，接種于預(yù)置有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，PBS沖洗。4%多聚甲醛固定20 min，0.3%Tritonx-100室溫孵育20 min，羊血清室溫封閉20 min，兔抗大鼠平滑肌α-actin抗體(1∶100)孵育[3]，4 ℃過夜。PBS沖洗后加入生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗后，DAB顯色5 min，顯微鏡下觀察。待顯色完成后用PBS沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(NC組)、PA組、EMO組、EMO+PA組。NC組VSMCs不做任何處理；PA組用PA(100 μmol·L-1)刺激24 h；EMO組用EMO(50 μmol·L-1)刺激24 h；EMO+PA組用不同濃度EMO(1、10、50 μmol·L-1)預(yù)孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h。RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達(dá)，Western blot法測(cè)定蛋白的表達(dá)。

2.4 RT-PCR測(cè)定

按照RNAfast200試劑盒說明書所示規(guī)程提取細(xì)胞總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。RNA提取后依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增CRP、TNF-α及iNOS基因。GAPDH上游引物(產(chǎn)物124 bp)：5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物：5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-5′；CRP上游引物(產(chǎn)物153 bp)：5′-CATCTGTGCCACCTGGGAGTC-3′，下游引物：5′-AAGCCACCGCCATACGAGTC-3′；iNOS上游引物(產(chǎn)物262 bp)：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′，下游引物：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′；TNF-α上游引物(產(chǎn)物381 bp)：5′-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′。產(chǎn)物電泳后，采用Quantity one 4.6軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶灰度，取目的基因與GAPDH的灰度值的比值為該目的基因的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.5 Western blot測(cè)定

用RIPA裂解液收集細(xì)胞，將細(xì)胞從六孔板中轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中，用破膜儀抽打3次，使蛋白充分溶解。將EP管靜置于冰上20 min，再離心15 min，吸取上清液，即得細(xì)胞總蛋白。利用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離等量蛋白，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入CRP(1∶100)、iNOS(1∶300)、TNF-α(1∶200)及GAPDH(1∶500)抗體12 h，洗膜后加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，洗膜后采用化學(xué)顯影，X線片曝光，并對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度掃描，做相對(duì)定量分析，以GADPH為內(nèi)參照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較使用ANOVA單因素方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外培養(yǎng)大鼠VSMCs的鑒定

倒置顯微鏡下，3～5 d即可見少量細(xì)胞爬出組織塊，細(xì)胞呈典型梭形，有一個(gè)橢圓形核，胞漿均質(zhì))。培養(yǎng)7～10 d，細(xì)胞局部成束狀平行排列，部分細(xì)胞多層重疊，呈典型高低起伏的“峰”、“谷”狀。使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，鑒定培養(yǎng)的第三代細(xì)胞。結(jié)果顯示：大于99%的細(xì)胞染色陽性，胞核不著色，胞漿顯棕黃色，見圖1。

3.2 大黃素抑制軟脂酸誘導(dǎo)的VSMCs炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

VSMCs先用不同濃度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)預(yù)孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h，提取細(xì)胞mRNA，RT-PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞中CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達(dá)。以GADPH為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)目的基因的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，100 μmol·L-1PA能顯著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-αmRNA的表達(dá)，50 μmol·L-1EMO本身對(duì)目的基因mRNA的表達(dá)無顯著影響。與PA組比較，不同濃度的EMO能夠抑制PA刺激的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達(dá)，其中高濃度的EMO差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

A.倒置顯微鏡下第4天細(xì)胞形態(tài)(×100)；B.倒置顯微鏡下第三代細(xì)胞形態(tài)(×100)；C.免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定大鼠血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(×400)。圖1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的鑒定

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01，***P <0.001；與軟脂酸組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P <0.001(n=3)。下同。圖2 大黃素抑制軟脂酸誘導(dǎo)的VSMCs炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

3.3 大黃素抑制軟脂酸誘導(dǎo)的VSMCs炎性細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)

VSMCs先用不同濃度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)預(yù)孵育24 h后，加入PA(100 μmol·L-1) 24 h，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞中CRP、iNOS及TNF-α蛋白的表達(dá)。以GADPH為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)目的蛋白的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，100 μmol·L-1PA能顯著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表達(dá)，50 μmol·L-1EMO本身對(duì)目的蛋白的表達(dá)無顯著影響。與PA組比較，不同濃度的EMO能夠抑制PA刺激的VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表達(dá)，其中高濃度的EMO差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 大黃素抑制軟脂酸誘導(dǎo)的VSMCs 炎癥細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)

4 討論

As是一種慢性炎性疾病，這一觀點(diǎn)已得到研究者的公認(rèn)。VSMCs在As的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其能分泌一系列的炎癥因子，如CRP、TNF-α、IL-6及MMPs等，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)，加劇As。

CRP作為心血管疾病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，在中風(fēng)、心肌梗死及冠心病等疾病的預(yù)防和治療中具有重要意義[4]，CRP也作為炎性細(xì)胞因子參與As的整個(gè)過程。研究顯示，CRP可以誘導(dǎo)VSMCs生成ROS、上調(diào)AT1-R的表達(dá)，活性氧(ROS)、AT1-R表達(dá)的增加又促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成及增厚，促進(jìn)VSMCs的增殖遷移，從而促進(jìn)粥樣斑塊的形成和破裂[5]，這一過程可能與MAPK及NF-κB的激活有關(guān)[6]。iNOS在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs等。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥介質(zhì)刺激時(shí)，iNOS催化合成大量NO，造成細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞壞死，釋放更多炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)，加劇iNOS的表達(dá)，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)粥樣斑塊的破裂[7]。TNF-α是生物體內(nèi)主要的促炎和免疫調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體的急、慢性炎癥，在人和小鼠的動(dòng)脈粥樣病變區(qū)域中都檢測(cè)到TNF-α，其分泌過多會(huì)引起炎癥因子的瀑布式釋放，造成組織細(xì)胞損傷。TNF-α可以誘導(dǎo)VSMCs炎癥因子IL-6、IL-1β的表達(dá)，可以促進(jìn)VSMCs成骨樣分化，增加鈣鹽沉積，從而促進(jìn)血管鈣化[8]。TNF-α還能激活VSMCs MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)VSMCs的增殖[9]。

EMO是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效單體，其在抑制細(xì)胞增殖、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面具有良好效果。臨床研究表明，EMO能降低全身炎癥反應(yīng)綜合征患者血清TNF-α和CRP的水平，有效抑制炎癥介質(zhì)的釋放及阻止炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，具有良好的抗炎作用[10]。通過體外實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)PA可以誘導(dǎo)大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA和蛋白水平的表達(dá)，其對(duì)VSMCs有直接的致炎作用，這表明PA可以直接通過炎癥介導(dǎo)As的發(fā)生發(fā)展。在核酸和蛋白水平上，EMO可以顯著抑制PA對(duì)大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的誘導(dǎo)作用，50 μmol·L-1的EMO本身對(duì)CRP、iNOS及TNF-α的表達(dá)沒有顯著的影響，表明EMO可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)而達(dá)到抗As的作用。EMO能抑制PA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而抑制AS發(fā)展的作用機(jī)制仍不明確，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果和具體的信號(hào)通路我們?nèi)匀晃粗枰M(jìn)一步的研究及探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)EMO可以抑制PA誘導(dǎo)的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的表達(dá)，提示EMO可以通過抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，從而達(dá)到抗As的作用，加深了我們對(duì)EMO抗炎機(jī)制和抗As的理解，為EMO的臨床應(yīng)用及傳統(tǒng)中藥大黃治療心血管疾病提供了參考。

[1] Ding Y，Zhao L，Mei H，et al.Exploration of emodin to treat alpha-naphthylisothiocyanate-induced cholestatic hepatitis via anti-inflammatory pathway[J].Eur J Pharmacol，2008，590(1)：377-386.

[2] 余少鴻，雷正明，張培明，等.大黃素對(duì)大鼠重癥胰腺炎TNFα、IL-6及胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2003，9(3)：59-61.

[3] 丁洪飛，黃勝超，李建文，等.改良大鼠血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40(1)：71-73.

[4] Kaptoge S，Di Angelantonio E，Lowe G，et al.C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease，stroke，and mortality：an individual participant meta-analysis[J].Lancet，2010，375(9709)：132-140.

[5] Ryu J，Lee C W，Shin J A，et al.FcγRIIa mediates C-reactive protein-induced inflammatory responses of human vascular smooth muscle cells by activating NADPH oxidase 4[J].Cardiovasc Res，2007，75(3)：555-565.

[6] Hattori Y，Matsumura M，Kasai K.Vascular smooth muscle cell activation by C-reactive protein[J].Cardiovasc Res，2003，58(1)：186-195.

[7] Hürlimann D，Ruschitzka F，Lüscher T.The relationship between the endothelium and the vessel wall[J].Eur Heart J，2002，4(suppl A)：A1-A7.

[8] Costanzo A，Moretti F，Burgio V，et al.Endothelial activation by angiotensin II through NF-kB and p38 pathways：Involvement of NF-kB inducible kinase(NIK)，free oxygen radicals，and selective inhibition by aspirin[J].J Cell Physiol，2003，195(3)：402-410.

[9] Minamino T，Yoshida T，Tateno K，et al.Ras induces vascular smooth muscle cell senescence and inflammation in human atherosclerosis[J].Circulation，2003，108(18)：2264-2269.

[10] Verzini F，De Rango P，Parlani G，et al.Effects of statins on early and late results of carotid stenting[J].J Vasc Surg，2011，53(1)：71-79.

封面介紹——紅旱蓮

【異名】紅旱蓮異名湖南連翹。

【基原】為藤黃科金絲桃屬植物湖南連翹的全草。

【原植物】湖南連翹HypericumascyronL.又名黃海棠。

【植物形態(tài)】為多年生草本，高1.3 m。全株光滑無毛。莖四棱形，淡棕色，上部有分枝。單葉對(duì)生；葉無柄；葉片寬披針形，長5-10cm,寬1-3cm。先端鈍尖，基部抱莖，邊緣全緣，兩面密布細(xì)小透明的腺點(diǎn)。花數(shù)朵排成頂生的二歧聚傘花序；花黃色，萼片5，卵圓形，具半透明腺點(diǎn)；花瓣5，鐮狀倒卵形，各瓣稍偏斜而旋轉(zhuǎn)；雄蕊多數(shù)，基部連合成5束，每束與花瓣對(duì)生；子房上位，圓錐形，花柱長，在中部以上5裂。蒴果圓錐形。種子多數(shù)，長橢圓形，褐色。花期6-7月，果期8-9月。

【性味與歸經(jīng)】苦，寒。歸肝經(jīng)。

【功能主治】涼血止血，活血調(diào)經(jīng)，瀉火解毒。注治血熱吐血、咯血、衄血、尿血、崩漏，跌打損傷，外傷出血，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，乳汁不下，肝火頭痛，黃疸，瘧疾，燙傷，濕疹，黃水瘡，毒蛇咬傷。

Inhibitory Effect of Emodin on Inflammatory Cytokines Expression Induced by Palmitic Acid in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

WU Di*，ZHONG Shanshan

(Department of pharmacy，Zunyi Medcal University，Zunyi Guizhou 563000，China)

Objective：To observe the effects of emodin on CRP，TNF-α and iNOS generations induced by palmitic acid in rat vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods：After VSMCs were pretreated with different concentrations of emodin(1，10，50 μmol·L-1) for 24 h，VSMCs were treated with palmitic acid(100 μmol·L-1) for 24 h.At the indicated time，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS in VSMCs were analyzed by RT-PCR，western blot，respectively.Results：In VSMCs，using 50 μmol·L-1of emodin for 24h before the stimulation with palmitic acid，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS expressions were significantly decreased comparing with palmitic acid group.Conclusion：Emodin inhibits inflammatory cytokines expression induced by palmitic acid in VSMCs and has effect on atherosclerosis by its anti-inflammatory activity.

Emodin；palmitic acid；vascular smooth muscle cells；cytokines

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.005

2014-06-23)

遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)項(xiàng)目(F-669)

*

吳迪，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)；E-mail：wd_32677@126.com