劉敏，丁萬隆，胡陳云，高原，李勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·中藥農(nóng)業(yè)·

人參內(nèi)生ge15菌株抑菌活性物質(zhì)的初步研究△

劉敏，丁萬隆，胡陳云，高原，李勇*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：探究人參內(nèi)生細(xì)菌ge15菌株對人參病原菌的作用機(jī)理，明確ge15菌株胞外分泌液中抑菌活性成分的提取方法、活性組分及抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。方法：通過硫酸銨沉淀、濃鹽酸沉淀及飽及正丁醇萃取等方法獲得菌株發(fā)酵液中抑菌活性成分；牛津杯法測定提取成分的抑菌活性。結(jié)果：從ge15菌株發(fā)酵液得到的提取液均有抑菌活性；對發(fā)酵上清液經(jīng)高溫和蛋白酶K處理，抑菌活性未見明顯變化。結(jié)論：ge15菌株能產(chǎn)生多種抑菌活性成分；抑菌成分對高溫和蛋白酶K穩(wěn)定。

人參；內(nèi)生細(xì)菌；抑菌物質(zhì)

人參P.ginsengC.A.Meyer為五加科人參屬多年生藥用植物，我國傳統(tǒng)名貴中藥材。由于人參具有強(qiáng)忌連作的特性，其中的人參土傳病害問題嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前，化學(xué)農(nóng)藥仍是人參病害防治的主要手段，但由此引發(fā)的人參農(nóng)殘超標(biāo)、生態(tài)環(huán)境惡化、出口受阻等問題非常嚴(yán)重。利用有益微生物防治植物病害是化學(xué)防治的有效替代途徑之一。內(nèi)生細(xì)菌在宿主植物中具有豐富的多樣性，與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了特殊的共生關(guān)系[2-3]。本課題組前期分離到的人參內(nèi)生細(xì)菌ge15菌株對人參黑斑菌Alternariapanax、人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans、人參疫病菌Phytophthoracactorum等多種人參土傳病原真菌有明顯抑制作用[4]。筆者通過對該菌株胞外分泌液中代謝產(chǎn)物的分離提取，明確了ge15菌株合成的抑菌活性成分組成情況及其抑菌活性的穩(wěn)定性，上述研究結(jié)果為人參及其近緣種屬植物的病害防治奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株

拮抗細(xì)菌ge15菌株和人參黑斑菌A.panax由本實驗室分離、保存。

供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：鮮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

PBS緩沖液：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44 g；KH2PO40.24 g；加蒸餾水至1000 mL，用Na2HPO4或KH2PO4調(diào)節(jié)pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性檢測方法 在距平皿中心2 cm處對稱擺放牛津杯，倒入PDA培養(yǎng)基，制成帶孔PDA平板。將人參黑斑菌菌餅(Φ6 mm)接種于平板中央后，每孔加入100 μL待測液。以無菌PBS緩沖液為空白對照(CK)，每種處理設(shè)3次重復(fù)。靜置過夜，22 ℃倒置培養(yǎng)5～7 d后觀察抑菌效果，測量菌落半徑。抑菌率=(r對照-r待測)/r對照×100%，r-菌落半徑。

1.2.2 菌株發(fā)酵上清液的制備及其抑菌活性檢驗 用接種環(huán)挑取1環(huán)經(jīng)活化的ge15菌株，接種至100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，33 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。按5%接種量將種子液接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，相同條件振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾得發(fā)酵上清液。以同批含菌發(fā)酵液為陽性對照，以無菌水為空白對照，進(jìn)行抑菌試驗，試驗平行3次重復(fù)。

1.2.3 抑菌蛋白粗提液的制備及其抑菌活性檢驗 取10 mL發(fā)酵上清液，緩慢加入固體硫酸銨顆粒，使其飽和度分別達(dá)到30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，4℃靜置過夜，10 000 r·min-1離心20 min。沉淀用0.02 mol·L-1的PBS緩沖液(pH 7.2)重懸至完全溶解，所得溶液裝入透析袋(截留分子量為8～14 kD)中除鹽，直至1%的BaCl2溶液滴定透析外液無沉淀生成。將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥，PBS緩沖液定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，即得粗蛋白提取液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用2.1的方法檢測不同飽和度硫酸銨提取液的抑菌活性，以發(fā)酵上清液為陽性對照，以無菌PBS溶液為空白對照，試驗平行重復(fù)3次。

1.2.4 粗脂肽提取物的制備其抑菌活性檢驗 取LB發(fā)酵上清液10 mL，用6 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)至pH 2.0，4 ℃靜置過夜，10 000 r·min-1離心20 min。所得上清液調(diào)節(jié)PH為中性后4 ℃保存?zhèn)溆?。所得沉淀用甲醇溶解，抽濾2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，所得干燥樣品用PBS緩沖液(0.02 mol·L-1，pH 7.2)定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，即得脂肽粗提物。用2.1的方法檢測脂肽粗提液和酸化上清液的抑菌活性，以發(fā)酵上清液為陽性對照，以無菌PBS溶液為空白對照，試驗平行重復(fù)3次。

1.2.5 有機(jī)溶劑萃取其抑菌活性檢驗 取10 mL發(fā)酵上清液3份，分別用等量石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，萃取兩次后合并有機(jī)相，分別旋干溶劑，用PBS緩沖液(0.02 mol·L-1，pH 7.2)定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，即得有機(jī)試劑萃取供試液。以同批發(fā)酵的上清液作為陽性對照，除菌PBS緩沖液為空白對照，進(jìn)行抑菌活性檢測。

1.2.6 發(fā)酵上清液抑菌活性成分穩(wěn)定性的初步測定 取10 mL菌株發(fā)酵上清液置于高壓滅菌鍋中121 ℃高溫滅菌30 min，0.22 μm濾膜除菌，濾液視為高溫、高壓處理。取發(fā)酵上清液1 mL，加入蛋白酶K(北京匯天東方科技有限公司)至終濃度1 mg·mL-1，37 ℃恒溫消解2 h，0.22 μm濾膜除菌，濾液視為蛋白酶處理。未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作為空白對照，參照2.1的方法測定樣品的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ge15菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性

研究發(fā)現(xiàn)，ge15菌株LB發(fā)酵液對人參黑斑菌生長有非常顯著的抑制作用，無菌發(fā)酵液上清液的抑菌活性略弱于含活體菌株的發(fā)酵上清液(圖1)。試驗結(jié)果表明，來自發(fā)酵上清液的抑菌活性成分對抑菌活性起主要作用，發(fā)酵液中的活體菌株也起到一定的抑菌作用。

S：菌株發(fā)酵液；S’：發(fā)酵上清液。圖1 發(fā)酵上清液的抑菌活性

2.2 抑菌蛋白粗提液的抑菌活性

粗蛋白提取物的抑菌活性與硫酸銨飽和度存在相關(guān)性，30%～90%硫酸銨飽和度下析出的粗蛋白均有抑菌效果；發(fā)酵液析出物對人參黑斑菌的抑制率隨硫酸銨飽和度增大而升高，70%飽和度時抑菌率達(dá)到最高值，隨后發(fā)酵液析出物對人參黑斑菌的抑制率逐漸下降(圖2)。試驗結(jié)果表明，70%飽和度的硫酸銨能夠最大限度地提取ge15菌株代謝產(chǎn)物中的抑菌蛋白。

圖2 硫酸銨沉淀物的抑菌作用

2.3 脂肽粗提取物的抑菌活性

菌株發(fā)酵上清液酸化后能產(chǎn)生明顯的絮狀沉淀，經(jīng)超低溫真空冷凍干燥后有淡黃色脂肽粗提物生成。抑菌試驗結(jié)果表明，脂肽粗提液對人參黑斑菌具有明顯的抑菌效果，但抑菌效果略弱于發(fā)酵上清液(圖3)，說明發(fā)酵液中還存在其他抑菌活性成分。酸化沉淀后的發(fā)酵上清液無抑菌效果，說明酸沉淀法能有效提取發(fā)酵液中的抑菌活性成分。

圖3 脂肽粗提物的抑菌活性

2.4 有機(jī)溶劑萃取液的抑菌活性檢驗

用3種極性存在顯著差異的有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵上清液中的活性成分發(fā)現(xiàn)，石油醚與乙酸乙酯提取液無抑菌活性，飽和正丁醇提取液有抑菌活性，說明極性較大的水飽和正丁醇能有效提取發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)(圖4)。

圖4 有機(jī)溶劑萃取液的抑菌活性

2.5 發(fā)酵液上清液中抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的初步測定

經(jīng)高溫、高壓處理，發(fā)酵上清液仍有較高抑菌活性(圖5a)，且與未處理發(fā)酵上清液的抑菌活性無明顯差別，說明發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。經(jīng)蛋白酶K處理后，發(fā)酵上清液仍然具有較強(qiáng)的抑菌活性(圖5b)，說明抑菌成分對蛋白酶K不敏感。實驗結(jié)果表明，ge15菌株發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)具有耐高溫高壓、耐蛋白酶水解的特性。

圖5 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的分子量約為1000 Da的脂肽類抗生素對高溫及蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性[5-6]。該類脂肽在溶液中達(dá)到特定濃度后會以聚合態(tài)的形式存在，并表現(xiàn)出蛋白質(zhì)的某些特征，可通過硫酸銨沉淀法進(jìn)行收集[7]。本文從ge15菌株發(fā)酵上清液中獲取的抑菌活性成分與上述文獻(xiàn)報道的脂肽類物質(zhì)的理化特征相近，推測可能是結(jié)構(gòu)相同或類似的脂肽類物質(zhì)[8]。另外，本文用不同極性的有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵上清液，發(fā)現(xiàn)極性較大的水飽和正丁醇萃取物具有較強(qiáng)的抑菌活性，說明ge15胞外分泌液中可能存在多種抗菌活性物質(zhì)。

ge15菌株經(jīng)鑒定為寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp.，有關(guān)該細(xì)菌的報道主要集中在芴[9]、苦馬豆素[10]、多環(huán)芳烴菲[11]、黃曲霉[12]等有毒有害物質(zhì)的生物脫毒以及土壤、水體的修復(fù)[13]等研究領(lǐng)域，將該細(xì)菌用于植物病害防治的研究鮮有報道，僅見張澤坤等[14]報道楊樹中的內(nèi)生寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp.對三倍體毛白楊和楓香組培苗的生根及幼苗生長有促進(jìn)作用，但并未開展該菌株的次生代謝產(chǎn)物的成分分析。本文在對ge15菌株開展抑菌活性研究的基礎(chǔ)上，就其次生代謝產(chǎn)物中的抑菌活性成分開展了初步研究，基本明確了抑菌活性物質(zhì)的活性部位，這為菌株抑菌活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抑菌機(jī)理研究奠定了良好基礎(chǔ)；另外，上述試驗結(jié)果的獲得也將有助于推動人參病害的生物防治。

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Preliminary Study on Antagonistic Substance Produced by Ginseng Endophytic Bacterium ge15

LIU Min，DING Wanlong，HU Chenyun，GAO Yuan，LI Yong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Beijing Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China)

Objective：To study the antagonistic mechanism of ginseng endophytic bacterium ge15，and clarify the extraction method，active components and the stability of antagonistic substance.Methods：Antagonistic substances were acquired from fermentation broth of ge15 by ammonium sulfate precipitation，concentrated hydrochloric acid precipitation and saturated n-butanol extraction.Antagonistic activities of extracts were examined by oxford cup method.Results：All extracts from fermentation broth of ge15 showed antagonistic activity against ginseng pathogen，and the antagonistic activity of suspension hardly changed when treated by high temperature and protease K.Conclusion：Some antagonistic substances may produced by ge15，and which are stable to high temperature and protease K.

Panaxginseng；endophytic bacterium；antagonistic substance

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.011

2014-09-21)

中央公益性科研院所基金項目(yz-12-17)；協(xié)和青年科學(xué)基金項目(3332013113)

*

李勇，副研究員，研究方向：藥用植物病害生物防治；E-mail：liyong@implad.ac.cn