李君，季濤，宿樹蘭，錢大瑋

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·中藥工業(yè)·

桑葉中黃酮類和酚酸類成分的提取工藝優(yōu)化△

李君，季濤，宿樹蘭*，錢大瑋

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京210023)

目的：對(duì)桑葉中黃酮類和酚酸類的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該類化學(xué)成分的資源化利用提供參考。方法：采用乙醇溶劑提取桑葉中黃酮類和酚酸類成分；采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；采用HPLC-DAD方法對(duì)其中3個(gè)黃酮類化學(xué)成分和3個(gè)酚酸類成分進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。結(jié)果：各因素對(duì)黃酮類成分提取率影響的程度排序?yàn)橐掖紳舛?料液比>提取時(shí)間>提取次數(shù)；各因素對(duì)酚酸類成分提取率影響的程度排序?yàn)樘崛r(shí)間>提取次數(shù)>料液比>乙醇濃度。通過HPLC-DAD分析其中6個(gè)資源性化學(xué)成分的評(píng)價(jià)結(jié)果及方差，黃酮類、酚酸類成分的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇濃度為85%，料液比為1∶40，提取時(shí)間為45min，提取次數(shù)為3次。結(jié)論：該提取工藝流程簡(jiǎn)單，提取率高，可為桑葉資源的開發(fā)利用提供參考。

桑葉；黃酮類；酚酸類；正交試驗(yàn)；提取工藝

桑葉為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉，其性寒，味甘苦，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，臨床上主要用于降血糖、降血脂等?，F(xiàn)代研究表明，桑葉中主要含有黃酮類、生物堿類、多糖類成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗衰老、抗氧化等多種生理活性[1-2]。此外，桑葉中還含有植物甾醇類、微量元素類、維生素類、氨基酸類等成分[3-4]。大量研究表明，桑葉降血糖作用與黃酮類、多糖類、生物堿類化合物密切相關(guān)[5-8]，黃酮類是其降糖主要有效成分之一。桑葉中黃酮類化合物約占桑葉干重的1%～3%，其中包括以槲皮素為母核的黃酮類成分如槲皮素(quercetin)、桑苷(tutin)、蘆丁(rutin)、異槲皮素(quercitrin)等；以山柰酚為母核的黃酮類成分如山柰酚(kaempferol)、紫云英苷(astragalin)等。桑葉中的有機(jī)酸類成分主要包括綠原酸(Chlorogenic acid)、新綠原酸(Neochlorogenic acid)、隱綠原酸(Cryptochlorogenic acid)等。Hunyadi A等[9]研究表明，桑葉中綠原酸成分具有降血糖作用。

筆者在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上[10-16]，對(duì)桑葉中黃酮類和酚酸類成分的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，通過正交試驗(yàn)、方法學(xué)考察，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)同時(shí)分析評(píng)價(jià)桑葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮素和紫云英苷6種活性成分，明確了桑葉黃酮類和酚酸類成分的最佳提取工藝參數(shù)，以期為桑葉中該類資源性化學(xué)成分的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695 Alliance高效液相色譜系統(tǒng)(四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器)；Sartorius BT125D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KH-500DV超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Anke LXJ-IIB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易科技發(fā)展有限公司)；PMB 53型快速水分測(cè)定儀(上海珂淮儀器有限公司)。

干燥桑葉購自安徽藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉片。蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為LGNR-5N9L，Y-076-120325，Z-020-120312，110753-201314，MUST-14043010，MUST-14041410)；乙腈(色譜純)；乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司)；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察了乙醇溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)4項(xiàng)因素，每項(xiàng)因素選用3個(gè)水平，以黃酮類和酚酸類成分含量為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2.2提取方法

桑葉粉碎至粉末，精密稱重3.0g，按表1所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件，采用乙醇溶劑回流提取，過濾，離心濃縮，過濾膜，進(jìn)行高效液相分析。

表1 桑葉黃酮和酚酸類正交試驗(yàn)因素水平表

2.3色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCBEH(100mm×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)，乙腈(B)，梯度洗脫(0～10min13%A；10～15min13%A；15～18min13%～20%A；18～43min20%A；43～45min20%～10%A)；流速：0.8mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μL。

注：A.混合對(duì)照品；B.樣品；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.蘆丁；5.異槲皮素；6.紫云英苷。圖1 桑葉中黃酮類和酚酸類成分(6種)的HPLC圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得線性回歸方程，蘆?。篩=2×109X-310 474(r=0.999 9)，線性范圍為11.9～238 μg·mL-1；異槲皮素：Y=3×109X-424 299(r=1)，線性范圍為14.3～286 μg·mL-1；紫云英苷：Y=4×109X-84 185(r=0.999 7)，線性范圍為22.2～444 μg·mL-1；新綠原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 6)，線性范圍為19.3～334 μg·mL-1；綠原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 0)，線性范圍為19.3～540 μg·mL-1；隱綠原酸：Y=2×109X+8×106(r=0.999 1)，線性范圍為32～438 μg·mL-1。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 移取蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品溶液，依照2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積進(jìn)行精密度考察，RSD分別為1.2%、0.9%、1.0%、1.1%、0.7%、0.9%(n=6)，表明精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取桑葉樣品6份，每份約1 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，依照2.3項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，蘆丁、異槲皮素、紫云英苷所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積的RSD分別為2.06%、0.47%和0.86%，說明所建立的液相分析方法重復(fù)性好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，以蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明，RSD分別為0.1%、0.4%、0.2%、0.6%、0.2%、0.4%(n=7)，說明提取的各組分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的桑葉樣品6份，各約1.0 g，精密稱定，分別按已知濃度的80%、100%、120%加入蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、隱綠原酸以及新綠原酸對(duì)照品，制備相應(yīng)的供試品溶液，并依照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量、加樣回收率及RSD值。蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、隱綠原酸以及新綠原酸的加樣回收率分別為95.2%、96.4%、93.6%、92.4%、95.1%、97.4%，RSD值分別為1.1%、1.6%、1.9%、2.1%、1.7%、1.9% 。

3 分析結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表2～6。由表2～6可看出，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)黃酮類和酚酸類成分提取影響程度不同。對(duì)黃酮類成分而言，各因素對(duì)提取率影響程度排序?yàn)橐掖紳舛?料液比>提取時(shí)間>提取次數(shù)；各因素對(duì)酚酸類提取率影響程度排序?yàn)樘崛r(shí)間>提取次數(shù)>料液比>乙醇濃度。黃酮類成分的最佳提取工藝為A3B2C2D3；酚酸類成分的最佳提取工藝為A1B2C2D3。正交結(jié)果和方差分析結(jié)果表明，A3條件下黃酮類成分提取率明顯優(yōu)于其他參數(shù)，D3條件下酚酸類成分提取率明顯優(yōu)于其他參數(shù)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合分析，確定桑葉黃酮類和酚酸類成分的最佳提取工藝參數(shù)為A3B2C2D3組合，即料液比為1∶40，85%乙醇回流提取45 min，提取3次。不同因素水平條件下，桑葉中黃酮類和酚酸類成分的含量見表4。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)黃酮類成分分析結(jié)果

表3 方差分析

4 最佳提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

稱取3份桑葉，各3 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的工藝條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，測(cè)定桑葉黃酮類和酚酸類成分含量。結(jié)果桑葉黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.130、1.101、1.123 mg·g-1；酚酸類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.821、3.798、3.810 mg·g-1，與正交試驗(yàn)最佳工藝組數(shù)據(jù)吻合，表明該最佳工藝提取桑葉黃酮類和酚酸類成分含量高，工藝穩(wěn)定，結(jié)果可信。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)酚酸類成分分析結(jié)果

表5 方差分析

表6 正交試驗(yàn)6種資源性化學(xué)成分的分析結(jié)果

5 結(jié)論與討論

本文通過正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，優(yōu)化桑葉黃酮類和酚酸類成分的提取工藝參數(shù)。研究表明，桑葉黃酮類成分提取的影響因素排序?yàn)榱弦罕?乙醇濃度>提取時(shí)間>提取次數(shù)；酚酸類成分提取的影響因素排序?yàn)樘崛〈螖?shù)>提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度。但兩類成分最佳工藝參數(shù)一致，均為料液比1∶40，85%乙醇回流提45 min，提取3次。

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD分析方法同時(shí)測(cè)定桑葉中3種黃酮類和3種酚酸類成分，為建立桑葉多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式提供參考。中藥成分的復(fù)雜性決定了采用單一成分和指標(biāo)來評(píng)價(jià)其質(zhì)量具有較大的片面性，因此亟需建立多成分質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)模式。國內(nèi)外對(duì)于桑葉活性成分的提取主要集中在總黃酮、生物堿和多糖成分的研究上[17-19]，而對(duì)于酚酸類成分的提取報(bào)道較少。本文建立的同時(shí)分析測(cè)定黃酮類與酚酸類資源性化學(xué)成分的HPLC-DAD分析方法，為桑葉及其制劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制，以及桑葉資源的開發(fā)利用提供了方法學(xué)參考和技術(shù)支撐。

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ExtractionOptimizationofFlavonoidsandPhenolicAcidsfromMulberryLeaves

LIJun，JITao，SUShulan*，QIANDawei

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：The study is aimed to optimize the extract parameters of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves in order to provide the basis for the resource utilization.Method：The ethanol solvent was selected to extract the flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves.And the extraction parameters were optimized by orthogonal experiment and HPLC-DAD method was adopted to analyze the flavonoids and phenolic acids.Results：The results showed that the influence degree of various factors for flavonoids is：ethanol concentration>ratio of material to liquid>extraction time>extraction frequency.For phenolic constituents，the extraction frequency>extraction time>ratio of material to liquid>ethanol concentration.Based on the six bioactive compositions and variance analysis data，the optimal parameters of the extraction for flavonoids and phenolic acids were：ethanol concentration85%，ratio of material to liquid was1∶40，extraction time is45minutes，3times of extraction，respectively.Conclusion：The extraction process of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves has the advantages of simplicity，high extraction rate，and it provides the basis and reference for the development and utilization of mulberry resources.

Mulberry leaves；flavonoids；phenolic acids；orthogonal experiment；extraction optimization

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373889，30973885)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-13-0873)

*

宿樹蘭，副教授，研究方向：中藥資源與利用；Tel：(025)85811916，E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.020

2014-10-31)