劉征輝，魏靜娜，趙琳琳，馬西蘭，郭永澤，程奕*

(1.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；2.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381；3.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381)

黃芩藥材多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的研究△

劉征輝1，2，魏靜娜1，2，趙琳琳1，2，馬西蘭1，2，郭永澤3，程奕3*

(1.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；2.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381；3.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381)

目的：建立黃芩藥材中4種活性成分(黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素)薄層鑒別及高效液相色譜同時(shí)定量的方法。方法：以CPACELL PAK C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液洗脫，測(cè)定波長(zhǎng)275 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1。結(jié)果：4種成分的線(xiàn)性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD均低于3.0%，加樣回收率為95.4～98.3%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于黃芩藥材的質(zhì)量控制。

高效液相色譜；黃芩藥材；黃芩苷；漢黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)屬唇形科植物，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、山東、河北、山西、河南、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古等地，其入藥部位為根。據(jù)藥典記載黃芩味苦性寒，有瀉火解毒、清熱燥濕、抗炎鎮(zhèn)痛、止血安胎等功能，對(duì)暑溫胸悶嘔吐、肺熱咳嗽、血熱妄行、高熱煩渴、濕熱下痢等具有良好功效。目前《中國(guó)藥典》及文獻(xiàn)大多采用高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷的含量[1-5]。由于黃芩中的功效成分主要為黃酮類(lèi)，而黃酮類(lèi)成分在儲(chǔ)存過(guò)程中也會(huì)相互轉(zhuǎn)換，且各成分均具有清熱解毒活性，藥典標(biāo)準(zhǔn)僅以黃芩苷一種成分來(lái)衡量其質(zhì)量有一定片面性，故試驗(yàn)采用HPLC 同時(shí)測(cè)定黃芩藥材中4 種活性成分的含量。該方法簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好，可作為黃芩藥材的質(zhì)量控制方法，也為相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695-2996高效液相色譜儀，CAMAG薄層分析系統(tǒng)，分析電子天平(METTLER AB 54)。黃芩苷(110715-200514)，黃芩素(111595-200604)，漢黃芩素(111514-200403)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；漢黃芩苷(20 mg；98%)，購(gòu)于天津金測(cè)分析技術(shù)有限公司。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。黃芩藥材(2年生，3年生，4年生，5年生)，采收于2013年9月份，由中國(guó)藥材集團(tuán)承德藥材有限責(zé)任公司提供(恒溫恒濕存放于公司標(biāo)本室)，經(jīng)張學(xué)文主任中藥師鑒定為承德產(chǎn)熱河黃芩。

2 室驗(yàn)方法的建立

2.1 薄層鑒別方法的建立

取本品粉末1.0 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)混合溶液20 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.0 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg、0.5 mg、0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取項(xiàng)下的供試品溶液與上述對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同的暗色斑點(diǎn)。具體薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

1.黃芩藥材；2.黃芩藥材；3.黃芩苷；4.黃芩素；5.漢黃芩素；6.黃芩對(duì)照藥材。圖1 黃芩薄層色譜圖

2.2 液相色譜條件的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：CPACELL PAK(5 μm，250 mm×4.6 mm)，PDA檢測(cè)器(190 nm～400 nm)，流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(49∶51)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫：30 ℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷3.80 mg、3.48 mg、3.04 mg、3.63 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取的儲(chǔ)備液各1 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即對(duì)照品混合溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取2年生、3年生、4年生、5年生的黃芩干燥粉末0.306 1 g、0.308 8 g、0.307 4 g、0.303 5 g，分別加70%乙醇溶液60 mL回流提取3 h，冷卻，過(guò)濾，濾液置100 mL容量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌濾紙和殘?jiān)匆翰⑷?00 mL量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液。

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，不同生長(zhǎng)年限的黃芩的液相色譜圖如圖2所示。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL置于25 mL 棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。分別取10 μL平行進(jìn)樣測(cè)定3 次，以峰面積平均值A(chǔ) 對(duì)進(jìn)樣量C(μg)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)列表

a2年生；b3年生；c4年生；d5年生；e混標(biāo)。圖2 不同生長(zhǎng)年限黃芩藥材的指標(biāo)性成分比較

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素峰面積RSD 分別為0.37%、0.19%、0.45%、0.21%(n=6)，其RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的供試品溶液，室溫下放置，分別于制備后0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素峰面積RSD 分別為0.97%、1.35%、0.96%、1.43%(n=6)，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次樣品，照“2.2.3”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素平均含量分別為14.7%、1.0%、0.37% 及0.10%，RSD分別為1.35%、0.98%、1.24%、1.11%(n=6)，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同批次本品6份，每份0.15 g，精密稱(chēng)定，分別精密添加含黃芩苷對(duì)照品溶液20.0 mL，漢黃芩苷對(duì)照品溶液10.0 mL，黃芩素對(duì)照品溶液5.0 mL，漢黃芩素對(duì)照品溶液1.0 mL，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備回收率用供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為97.4%、98.3%、96.9%、95.4%，RSD為1.25%。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 一般指標(biāo)

按照中國(guó)藥典對(duì)黃芩藥材所含水分、灰分和浸出物進(jìn)行分析測(cè)定，得到黃芩的這些指標(biāo)均符合中國(guó)藥典2010年版一部黃芩標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定，并且這些一般指標(biāo)與年份關(guān)系不大。其結(jié)果如表1所示。

表2 不同生長(zhǎng)年限黃芩指標(biāo)性成分列表 %

3.2 有效成分測(cè)定結(jié)果

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 %

由表3可知，黃芩藥材中有效成分的含量基本上是按照年份的增加而增加，可見(jiàn)生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)功效成分含量相對(duì)也越高。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器在190～380 nm內(nèi)分別掃描混合對(duì)照品溶液中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的色譜峰紫外吸收。其最大吸收波長(zhǎng)分別為277.2、273.7、274.9、274.9 nm(如圖3所示)，故設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。

4.2 流動(dòng)相的考察

試驗(yàn)過(guò)程中以甲醇-0.1%磷酸溶液分離黃芩藥材中黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素四個(gè)活性成分，參照文獻(xiàn)色譜條件[6-8]，適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例至(49∶51)，上述4 種成分得到較好分離效果。

圖3 各指標(biāo)性成分的紫外吸收?qǐng)D

4.3 多指標(biāo)同時(shí)定量

《中國(guó)藥典》黃芩項(xiàng)下其質(zhì)量控制是單獨(dú)測(cè)定黃芩苷，由于黃酮類(lèi)成分在在一定環(huán)境下會(huì)相互轉(zhuǎn)換，藥典標(biāo)準(zhǔn)單以黃芩苷來(lái)衡量其質(zhì)量有一定片面性，本試驗(yàn)采取液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芩藥材中4種活性成分[9-10]。本方法較藥典方法所控制指標(biāo)更全面合理，為黃芩藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供技術(shù)依據(jù)。市面上以黃芩為原料的中成藥[11-15]較多，但均以黃芩苷單一成分來(lái)控制。多指標(biāo)成分同時(shí)定量是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究的主要方向，本試驗(yàn)方法正是實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)，將可以廣泛應(yīng)用與這類(lèi)中成藥中以綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量。

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Multi-indexComprehensiveEvaluationofRadixScutellariae

LIU Zhenghui1，2，WEIJingna1，2，ZHAOLinlin1，2，MAXilan1，2，GUOYongze3，CHENGYi3*

(1.TianjinHigh-standardQualityTestingLab.，Tianjin300081，China；2.TianjinCenterforQualityTestingofTCM，Tianjin300081，China；3.TianjinInstituteofAgricuLturalQualityStandardandTestingTechnology，Tianjin300381，China)

Objective：：To establish a method for quantitative determination of four active ingredients(baicalin，wogonoside，baicalein，wogonin)in Radix Scutellariae by TLC and HPLC.Methods：The chromatographic separation was achieved on a CPACELL PAK C18column(5 μm，250 mm×4.6 mm)，the mobile phase was methanol -0.1% phosphate acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was 275 nm，and the column temperature was 30 ℃.Results：The established method showed a good linear relationship for four components，the RSD were less than 3.0%，recovery was 95.4%～98.3%.Conclusion：The method is simple，sensitive，accurate and can be used for quality control of Radix Scutellariae.

HPLC；Radix Scutellariae；Baicalin；Wogonoside；Baicalein；Wogonin

2014-09-16)

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI07B04)，華北地區(qū)黃芩規(guī)范化種植基地優(yōu)化升級(jí)及系列產(chǎn)品綜合開(kāi)發(fā)研究。

*

程奕，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品、土壤肥料及中藥檢測(cè)及科研工作；Tel：(022)23678678，E-mail：cychengyi99@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.008