楊智峰，高玉娟，李敬梅

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

·基礎研究·

甘草顯微定量的方法研究△

楊智峰1*，高玉娟1，李敬梅2

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

目的：完善甘草顯微定量的方法。方法：在已有顯微定量方法的基礎上，以混懸制樣代替“水飛”制樣，以血球計數(shù)板代替普通載玻片；利用線性分析方法確定取樣量，用正交試驗方法，優(yōu)化制片用混懸液配比和定量需要觀察制片的數(shù)量，進行混懸液穩(wěn)定性考察，確定實驗用時。結(jié)果：樣品細度要求100目，樣品定量需制片10張，記錄顯微特征個數(shù)并計算。結(jié)論：引用血球計數(shù)板，提高顯微定量的易操作性和準確性，方法是可行的。

甘草；顯微特征常數(shù)；顯微定量；統(tǒng)計分析；正交試驗

藥材顯微定量的方法研究，康廷國、苑冬梅教授研究的較多，隨后在中成藥組分定量、中藥炮制方面有應用，用混懸劑以“水飛”方法制樣，利用傳統(tǒng)載玻片、蓋玻片、微量進樣器、網(wǎng)格式測微尺和顯微鏡進行，每個樣品制片5～10張[1-6]。理論根據(jù)在于，單位藥材樣品顯微特征個數(shù)是常數(shù)。其缺點在于：“水飛”方法制樣誤差較大，顯微進樣器的孔徑難以滿足要求，定量溶液制片不易操作，全蓋玻片觀察計數(shù)困難很大，誤差不易控制，局部計數(shù)體積難以確定，因此該法需要完善。

筆者對甘草顯微定量方法進行了改進。用混懸劑以定量混懸的方法制樣，利用血球計數(shù)板、蓋玻片、定量滴管和顯微鏡進行，理論根據(jù)和樣品制片數(shù)同上，希望能提高顯微定量法的精度，便于應用。

1 實驗用品、儀器與材料

1.1 實驗用品及儀器

血球計數(shù)板，蓋玻片，樣品盒，10 mL容量瓶，定量滴管。千分之一電子天平，Olmypus顯微鏡(使用鏡頭15 mm×10 mm)，烘箱，沖筒，100目套篩。

1.2 材料

化學純甘油、水合氯醛和蒸餾水。

共收集15份甘草樣品，其中1～5號采自陜西神木縣(批號：20120825、20120826、20130821、20130823、20140920)，6～15號為市售甘草(西安萬壽路藥材市場，產(chǎn)地：甘肅，批號：20111128、20120816、20130412、20130618、20140311、20111026、20120815、20130810、20140615、20140721)，所有樣品經(jīng)本文第一作者鑒定，1～10號為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根，11～15號為脹果甘草GlycyrrhizainflataBat的干燥根。

2 方法

2.1 樣品粉碎

由于血球計數(shù)板空間高度為0.1 mm，即100 μm，計算甘草樣品粉碎應為100目。預試驗證明，100目甘草樣品，易于制成混懸液，初步穩(wěn)定性考察可在30 min以上。取甘草樣品，悶潤，切片，65 ℃烘干，沖筒粉碎，不留殘渣，過100目篩，細粉備用。

2.2 制樣

取甘草樣品粉末適量(多在100 mg以下)，加水合氯醛液適量，再加一定濃度的稀甘油適量，振搖混懸，定容于10 mL容量瓶中，振搖混勻，備用。

2.3 血球計數(shù)板樣品池充液量

經(jīng)測量和計算，一個樣品池需混懸液約0.02 mL。

2.4 滴管液滴大小考察

取滴管，吸取1 mL混懸液，10次，記錄1 mL混懸液滴出液滴的數(shù)量，并記錄，經(jīng)計算1滴約0.046 mL能滿足樣品池充液要求。

2.5 制片

用驗證過的滴管(1 mL溶液，滴20滴左右)，滴一滴，進入蓋有蓋玻片的血球計數(shù)板樣品池中，兩個樣品池各一滴，即成。

2.6 顯微觀察

每個樣品制片10張，觀察、記錄20個數(shù)據(jù)，因每個計數(shù)板有兩個樣品池，要求2 h內(nèi)完成，此由顯微特征在混懸液中的穩(wěn)定性決定。

2.7 樣品計數(shù)顯微特征的確定

計數(shù)顯微特征在實驗時間內(nèi)穩(wěn)定，形態(tài)上沒有變化，如部分溶解，同時要易于觀察。

2.8 顯微特征個數(shù)和藥材顯微特征常數(shù)的計算

由于血球計數(shù)板一個樣品池中大方格體積為0.4 mm3，計數(shù)僅計大方格中顯微特征個數(shù)，若以n張片子中顯微特征個數(shù)(X)為基數(shù)，則10 mL樣品液中顯微特征個數(shù)(Y)的計算公式：Y=12 500X/n。10 mL樣品混懸液中藥材質(zhì)量(M，mg)，該藥材顯微特征常數(shù)(K)為：K=Y/M(個·mg-1)。

3 實驗

3.1 混懸液穩(wěn)定性試驗

取甘草樣品適量(陜西神木，批號：20120826，51.5 mg)，加混懸液(由60%稀甘油和水合氯醛試液組成，比例19∶1)，定容于10 mL容量瓶中，搖勻，每隔20 min制片1次，每次10張，比較前后計數(shù)情況，RSD=0.95%，確定溶液穩(wěn)定的時間為2 h。

3.2 線性范圍考察

取甘草樣品(陜西神木，批號：20120826)0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、010 g，用60%稀甘油和水合氯醛試液，定容于10 mL容量中，配比19∶1，各樣品制片10張，記錄顯微特征個數(shù)，進行單位質(zhì)量與顯微特征個數(shù)關(guān)系的回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)，與相關(guān)系數(shù)臨界值相比，高度相關(guān)，回歸方程：Y=423.433 1X+122 153，r=0.996 7，線性范圍在40～100 mg。

3.3 制片影響因素的考察

從預試驗情況看，影響顯微特征計數(shù)的因素有稀甘油濃度、稀甘油與水合氯醛試液配比和觀察片子的數(shù)量。故進行四因素三水平正交試驗，樣品細度100目，取樣量50～60 mg，因素水平安排見表1，試驗設計及極差分析見表2，方差分析見表3。

表1 制片正交試驗因素水平表

觀察方法：取樣，稱量，用規(guī)定溶液或試劑，按一定比例，混懸樣品，定容于10 mL容量瓶中；取血球計數(shù)板，蓋上蓋玻片，用滴管給每個樣品池滴液一滴，注滿，一次制夠所需片數(shù)，置顯微鏡下觀察，記錄每個樣品池大方格中顯微特征個數(shù)，按上法計算顯微特征常數(shù)(個·mg-1)。

從方差分析情況可知，實驗用甘油溶液濃度對顯微特征常數(shù)確定影響非常顯著，觀察片數(shù)對其影響顯著，綜合極差和用時情況，最終確定顯微定量方法：取樣，稱量，用60%甘油溶液和水合氯醛試液(19∶1)混懸，用血球計數(shù)板制片10張；觀察，計算即可。

表2 制片正交試驗設計及結(jié)果

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.10(2，2)=9。

3.4 重復性考察

稱取甘草樣品(陜西神木，批號：20120826)6份，每份約50 mg，用60%甘油液和水合氯醛試液，19∶1混懸，定容于10 mL容量瓶中，每份制片10張，記錄并計算顯微特征常數(shù)，均數(shù)1 490.5個·mg-1，RSD=1.47%，重復性好。

3.5 樣品顯微特征常數(shù)均數(shù)的確定和不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的比較

取神木甘草、甘肅甘草和隴西甘草，約50 mg，各3份，以確定方法制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄顯微特征個數(shù)，計算樣品顯微特征常數(shù)均值，分析不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)見表4。用SPSS17軟件進行成對資料統(tǒng)計分析，神木樣品與甘肅樣品的顯微特征常數(shù)均值之間差異有統(tǒng)計學意義，置信系數(shù)為0.01；神木樣品與隴西樣品的顯微特征常數(shù)均值之間差異有統(tǒng)計學意義，置信系數(shù)為0.01。

表4 不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)

4 結(jié)果

血球計數(shù)板用于甘草顯微定量是可行的，具體方法：取過100目篩樣品適量，加入水合氯醛試液1份，然后加入60%甘油19份，混懸定容于10 mL容量瓶中，用確定過液滴大小的滴管，吸取一滴，滴于已蓋有蓋玻片的血球計數(shù)板上，充滿樣品池，制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄四個大方格內(nèi)的顯微特征個數(shù)，計算即可。從重復性實驗數(shù)據(jù)的RSD看實驗可重復性強。血球計數(shù)板樣品池高度一定，樣品池計數(shù)面積一定，故可提高樣品的觀察精度。

5 討論

不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)的均值差異，是植物種間差異和產(chǎn)地差異共同作用的結(jié)果，物種差異影響較大，產(chǎn)地差異影響較小，可以肯定的是，神木產(chǎn)甘草與甘肅產(chǎn)甘草不同。

從本研究看，顯微特征常數(shù)是一個區(qū)間，這個區(qū)間受物種、生長年限和產(chǎn)地影響，但在一定范圍之內(nèi)，具體情況將在后續(xù)研究報告中予以詳述。

[1] 陳聰慧，康廷國.金銀花顯微特征常數(shù)與化學成分相關(guān)性研究[J].中藥材，2011，34(9)：1373-1376.

[2] 張洪春，君海波，王婷，等.老鸛草類藥材的顯微定量研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008，10(5)：155-156.

[3] 苑冬梅，劉揚，欒曉靜，等.黃柏的顯微定量研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25(5)：964-966.

[4] 苑冬梅，欒曉靜，鞠慶波，等.中藥顯微定量法的應用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(4)：459-460.

[5] 劉歆韻，康廷國.逍遙丸中白芍、茯苓的顯微定量研究[D].大連：遼寧中醫(yī)藥大學，2010.

[6] 吳楠，康廷國.杞菊地黃丸中菊花、八珍益母丸中益母草顯微定量研究[D].大連：遼寧中醫(yī)藥大學，2011.

AStudyofMicro-quantitativeMethodsforLicorice

YANGZhifeng1，GAOYujuan1，LIJingmei2

(1.ShaanxiAcademyoftraditionalChinesemedicine，Xi’an，710003，China； 2.FirstAttachedHospitaltoXi’anMedicalCollege，Xi’an710077，China)

Objective：To improve the micro-quantitative methods for licorice.Methods：Based on existing micro-quantitative methods，“ShuiFei” example preparation pattern (the process by which solid powder and liquid are grinded together in order to make suspension or remove contaminants) replaced by suspending example preparation pattern，and substitute blood counting plates for microscope slides.Sampling number was determined by linear analysis.The proportion of suspension for plates making as well as the number of sampling plates needed to be observed to confirm the quantity were optimized by orthogonal experiment method，then the inspects on suspension stability was casted and experiments time was confirmed.Results：It turned out that sampling fineness should be 100 mesh，and determination of sample quantity needed 10 slides.After the preparation，the number of micro-characteristics of samples was counted and calculated.Conclusion：It is a practical way by using blood counting plates to increase the handle ability and accuracy of micro-quantitative method.

Licoricer；micro-characteristic constant；micro-quantitation；statistic analysis；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.013

2014-12-03)

陜西省科技攻關(guān)項目(2012K19-03-08)

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楊智峰，研究員，研究方向：生藥學和中藥鑒定；E-mail：yzfeng_001@163.com