米振清，劉斌，2*

(1.山東省泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000； 2.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

·中藥工業(yè)·

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定黃芪護(hù)肝丸中5種活性成分的含量

米振清1，劉斌1，2*

(1.山東省泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000； 2.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芪護(hù)肝丸中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚5種活性成分含量的方法。方法：采用ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%磷酸的水溶液(B)，梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：芍藥苷為230 nm，橙皮苷和五味子醇甲為217 nm，大黃素和大黃酚為254 nm。結(jié)果：芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為5.12～102(r=0.999 6)、10.4～207(r=0.999 8)、2.58～51.6(r=0.999 7)、3.22～64.4(r=0.999 8)、2.45～49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，平均加樣回收率(n=6)分別為98.6%、99.2%、98.9%、98.3%、98.3%，RSD分別為1.1%、1.0%、1.3%、1.2%、1.2%。結(jié)論：本法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于黃芪護(hù)肝丸的質(zhì)量控制。

高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器；黃芪護(hù)肝丸；芍藥苷；橙皮苷；五味子醇甲；大黃素；大黃酚；含量

黃芪護(hù)肝丸是在中醫(yī)臨床驗(yàn)方和現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究基礎(chǔ)上由黃芪、赤芍、陳皮、五味子、大黃等16味中藥組成的水丸，具有清熱解毒、益氣活血、保肝護(hù)肝之功能，用于甲肝或乙肝的治療。其中，黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表的作用，其有效成分黃芪甲苷具有抗血栓、抗腫瘤、保肝等作用[1]；赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的作用，其有效成分芍藥苷具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、舒張平滑肌的作用[2]；陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的作用，橙皮苷具有降脂、抗血栓、抗腫瘤等作用[3]；五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的作用，其有效成分五味子醇甲具有保肝護(hù)肝，促進(jìn)肝糖原合成等作用[4]；大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的作用，大黃素和大黃酚具有瀉下、抗炎、降壓、降血脂等作用[5-6]。目前對(duì)于上述幾種成分的含量測(cè)定方法的報(bào)道較多[7-14]，除黃芪甲苷的含量測(cè)定采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)外，其余成分的含量測(cè)定方法皆為高效液相-紫外檢測(cè)器檢測(cè)，且未見(jiàn)關(guān)于黃芪護(hù)肝丸多成分含量測(cè)定方法的研究。本研究以赤芍中的芍藥苷、陳皮中的橙皮苷、五味子的五味子醇甲、大黃中的大黃素和大黃酚為定量指標(biāo)，根據(jù)5種成分紫外吸收特征的不同，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢查法，在3個(gè)紫外波長(zhǎng)下同時(shí)對(duì)黃芪護(hù)肝丸中的5種成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，本法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為黃芪護(hù)肝丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LC solution色譜工作站(日本島津公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler Toledo XS205DU)。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、五味子醇甲對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110736-201438，110721-201316，110857-201010，110756-201110，110796-201319)；黃芪護(hù)肝丸(自制，每20丸重1 g，批號(hào)分別為20140801，20140802，20140803)；甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，35%A；10～15 min，35%～60%A；15～35 min，60%A；35～40 min，60%～80%A；40～60 min，80%A；60～65 min，80%～35%A；65～70 min，35%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：芍藥苷為230 nm，橙皮苷和五味子醇甲為217 nm，大黃素和大黃酚為254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。芍藥苷、橙皮苷、五味子醇苷、大黃素和大黃酚的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按橙皮苷色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為512、1036、258、322、245 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇制成每mL中分別含芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素、大黃酚51.2、104、25.8、32.2、24.5 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品100丸，研細(xì)，混勻，取約2.0 g，精密稱定。置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率為300 W，頻率為50 KHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量。用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按黃芪護(hù)肝丸處方比例，分別制備不含赤芍、陳皮、五味子、大黃的黃芪護(hù)肝丸陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備陰性供試品溶液。

2.3 空白試驗(yàn)

按2.1色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依法測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品溶液中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的色譜峰與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致，陰性供試品溶液在與芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。HPLC圖譜見(jiàn)圖1～6。

注：1.芍藥苷；2.橙皮苷；3.五味子醇甲；4.大黃素；5.大黃酚。下同。圖1 對(duì)照品HPLC圖

圖2 樣品HPLC圖

圖3 缺赤芍陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖4 缺陳皮陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖5 缺五味子陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖6 缺大黃陰性對(duì)照樣品HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取2.2.1項(xiàng)下芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定。以質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為芍藥苷：Y=3.879×104C+8.463×103(r=0.999 6)；橙皮苷：Y=2.168×104X+1.273×104(r=0.999 8)；五味子醇甲：Y=7.342×104X+5.732×103(r=0.999 7)；大黃素：Y=2.469×104X+6.056×103(r=0.999 8)；大黃酚：Y=3.096×104X+1.335×103(r=0.9998)，芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為5.12～102、10.4～207、2.58～51.6、3.22～64.4、2.45～49.0 μg·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積考察精密度，芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.62%、0.81%、0.63%、0.62%和0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取黃芪護(hù)肝丸(批號(hào)：20140801)，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.98、2.2、0.50、0.68、0.50 mg·g-1，RSD分別為1.5%、1.4%、1.3%、1.3%和1.5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取黃芪護(hù)肝丸(批號(hào)：20140801)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，依2.1色譜條件分別在供試品溶液制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.1%、1.5%、1.2%、1.0%和1.1%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的黃芪護(hù)肝丸(20140801)適量，研細(xì)，稱取約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入2.2.2項(xiàng)下的芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依2.1色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算各成分加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

取本品3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算樣品中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3) /mg·g-1

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

本研究分別采用超聲和回流提取方法，分別以甲醇、70%甲醇溶液、50%甲醇溶液為溶媒，分別超聲處理15、30 min以及加熱回流30、60 min，制備供試品溶液。比較發(fā)現(xiàn)，5種待測(cè)成分在甲醇溶液中超聲提取30 min提取效果較好，雜質(zhì)干擾少，且操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于5種成分的紫外光譜差異較大，為了能同時(shí)檢測(cè)5種活性成分，采用二極管陣列檢測(cè)器，多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)各成分的含量。芍藥苷在230 nm處有最大吸收，且吸收值高，分離度好，故選擇此波長(zhǎng)檢測(cè)；橙皮苷在207、284 nm處有特征吸收，且靈敏度高，無(wú)干擾峰；五味子醇甲在217、252 nm處有特征吸收，但均在217 nm處有較大吸收，因此選擇217 nm作為橙皮苷和五味子醇甲共同的測(cè)定波長(zhǎng)；大黃素和大黃酚共有的特征吸收均為254、266、288 nm，因均在254 nm處有較大吸收，且靈敏度高，無(wú)干擾峰，因此選擇254 nm作為共同的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

筆者參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-14]，分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3種不同的流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方法，5種待測(cè)活性成分的峰形及分離度均良好，保留時(shí)間適宜。使用本法測(cè)定的專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可結(jié)合黃芪護(hù)肝丸中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法綜合評(píng)價(jià)黃芪護(hù)肝丸的質(zhì)量。

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SimultaneousDeterminationofFiveKindsofComponentsinHuangqihuganPillsbyHPLC-DAD

MIZhenqing1，LIUBin1，2*

(1.TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China； 2.TaishanMedicalUniversity，Taian271000，China)

Objective：To establish an HPLC method for determination of five bioactive components in Huangqihugan pills，including paeoniflorin，hesperidin，schisandrin、emodin and chrysophanol.Methods：A stable HPLC method was established on a ZORBAX SB-C18column，the mobile phase consisted of methanol (A)-0.1% (w) phosphoric acid(B) as mobile phase in a gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30 ℃.The detection wavelength was set at 230 nm for paeoniflorin，217 nm for hesperidin and schisandrin，254nm for emodin and chrysophanol，respectively.Results：The linear ranges of paeoniflorin，hesperidin、schisandrin、emodin and chrysophanol were 5.12-102 (r=0.999 6)，10.4-207(r=0.999 8)，2.58-51.6(r=0.999 7)，3.22-64.4(r=0.999 8) and 2.45-49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，respectively.The average recovery were 98.6%、99.2%、98.9%、98.3% and 98.3%，repectively.RSD were 1.1%、1.0%、1.3%、1.2% and 1.2%，respectively.Conclusion：The established method is specific，accurate and reproducible，which can be used for the quality control of Huangqihugan pills.

HPLC-DAD；Huangqihugan pills；paeoniflorin；hesperidin；schisandrin；emodin；chrysophanol； content

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.022

2014-12-25)

*

劉斌，主管藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制；Tel：(0538)8334565，E-mail：liubin8247@sina.com